沈圓兵 陳余清 王效靜 李 偉 舒紅梅

前期體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，HIF-1α和survivin在NSCLC中呈高表達(dá)，HIF-1α與survivin潛在啟動(dòng)子結(jié)合上調(diào)survivin基因的轉(zhuǎn)錄活性，且對(duì)survivin啟動(dòng)子的調(diào)控具有腫瘤特異性[1]。Li等[2]認(rèn)為HIF-1α在不同腫瘤中對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果不同，沉默HIF-1α的表達(dá)能否抑制肺癌的生長(zhǎng)，且對(duì)survivin的表達(dá)是否有無(wú)影響，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)此相關(guān)報(bào)道。因此，我們采用HIF-1α穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Mi RNA質(zhì)粒的A549細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，觀察HIF-1α基因沉默對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及survivin表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討HIF-1α在肺癌發(fā)病中的分子機(jī)制，為肺癌靶向治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

荷瘤雄性裸鼠15只，4～6周齡，體重18～24 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

分別轉(zhuǎn)染HIF-1α-Mi RNA、無(wú)意義序列Mi RNA，空質(zhì)粒載體的A549細(xì)胞株由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存，以含10％胎牛血清的HAMs-F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；鼠抗人HIF-1α和鼠抗人survivin單克隆抗體購(gòu)自Santa公司，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 A549荷瘤鼠模型的建立及基因治療觀測(cè) 將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組A549細(xì)胞株[空白對(duì)照組、無(wú)意義序列轉(zhuǎn)染組和實(shí)驗(yàn)組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1α-MiRNA的真核表達(dá)載體)],胎盤藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力在90％以上，每只裸鼠背部皮下接種各組處理細(xì)胞懸液0.1 ml，每3 d測(cè)量1次腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，根據(jù)公式(腫瘤體積=腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2×0.52)計(jì)算腫瘤體積，觀察3組荷瘤鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，接種60 d后，頸椎脫臼處死裸鼠，剝離腫塊并稱重，計(jì)算抑瘤率。

1.3.2 免疫組化染色 嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，參照Couzin等[3]的細(xì)胞計(jì)數(shù)，用高倍視野(×400)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率(％)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％，HIF-1α和survivin陽(yáng)性反應(yīng)以胞質(zhì)或胞核內(nèi)見(jiàn)棕黃色顆粒。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法半定量檢測(cè)腫瘤組織中HIF-1α、survivin mRNA的表達(dá) 收集各組組織細(xì)胞約6×106個(gè)，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增HIF-1α、survivin片段。測(cè)定PCR產(chǎn)物cDNA條帶和GAPDH內(nèi)參照條帶的吸光度(A)值的比值，作為HIF-1α、survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)的引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

1.3.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照碧云天TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇10個(gè)視野,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況

以皮下瘤體結(jié)節(jié)直徑>0.5 cm為接種成瘤標(biāo)準(zhǔn)，3組裸鼠成瘤率為100.0％，無(wú)1例死亡。由表2可見(jiàn)，皮下成瘤后3組腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯區(qū)別，接種后第25天開(kāi)始，空白對(duì)照組和無(wú)意義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組腫瘤體積均顯著大于實(shí)驗(yàn)組(P均<0.05)，45天后具有顯著性差異(P<0.01)。接種后第60天，處死裸鼠，剝離腫瘤(圖1)并稱重，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織瘤體重量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，抑瘤率高達(dá)68.9％(表3)。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

表2 各組腫瘤體積的比較(±s)

表2 各組腫瘤體積的比較(±s)

組別腫瘤體積(mm3)10天16天25天45天54天60天HIF?1αmiRNA97．47±9．29143．48±10．12263．75±15．01?499．88±32．55??622．58±33．84??746．65±70．70??無(wú)意義序列107．26±13．45163．19±14．11296．89±20．00?646．18±76．14??834．80±88．73??989．15±114．93??正常104．33±10．67164．28±19．95295．94±29．65?660．89±72．01??852．38±90．01??1004．80±111．65??

注：與HIF-1α MiRNA組比較，*為P< 0.05，**為P< 0.01

圖1 3組裸鼠移植瘤剝離后的瘤體變化

1為實(shí)驗(yàn)組;2為無(wú)意義序列轉(zhuǎn)移組;3為空白對(duì)照組

表3 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)裸鼠移植瘤的抑瘤率

2.2 免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α和survivin表達(dá)強(qiáng)度分別為(24.56±5.83)％和(29.08±3.99)％，明顯低于空白對(duì)照組[(69.88±6.66)％和(72.40±5.29)％]和無(wú)意義序列轉(zhuǎn)染組[(65.52±5.83)％和(68.88±4.47)％]，P均<0.01，兩對(duì)照組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

2.3 HIF-1α和survivin mRNA的表達(dá)結(jié)果

HIF-1α和survivin RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中HIF-1α 和survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.06±0.01和0.44±0.21，明顯低于空白對(duì)照組(0.71±0.11和1.24±0.09)和無(wú)意義序列轉(zhuǎn)染組(0.64±0.15和1.23±0.04)(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組與無(wú)意義序列轉(zhuǎn)染組比較HIF-1α和survivin mRNA表達(dá)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)HIF-1α mRNA表達(dá)

1為實(shí)驗(yàn)組;2為無(wú)意義序列轉(zhuǎn)移組;3為空白對(duì)照組

圖3 RT-PCR檢測(cè)survivin mRNA表達(dá)

1為空白對(duì)照組;2為無(wú)意義序列轉(zhuǎn)移組;3為實(shí)驗(yàn)組

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)為6.10±1.19，顯著高于空白對(duì)照組3.30±0.95和無(wú)意義序列對(duì)照組2.70±0.82,P<0.01,見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞凋亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)情況

3 討論

肺癌是目前全球死亡率最高的惡性腫瘤，在我國(guó)，肺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)已成為我國(guó)城市人口癌癥死亡的首要原因。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見(jiàn)的類型，約占85％，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌患者的5年生存率約為8.9％[4]，在實(shí)體瘤中，10％～35％的腫瘤細(xì)胞處于乏氧狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)乏氧的1個(gè)重要原因[5]。目前，已在多種惡性腫瘤如子宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌等腫瘤及癌前病變中檢測(cè)到HIF-lα蛋白的過(guò)表達(dá)[6]，F(xiàn)an等[7，8]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期越晚，HIF-1α表達(dá)越高，且越是發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，HIF-1α表達(dá)率就越高。有研究[9]報(bào)道HIF-1α介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的放化療抵抗，而且使腫瘤細(xì)胞更具有侵襲性，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗，HIF-1α的諸多特性使得HIF-1α成為抗癌治療的主要靶點(diǎn)。因此，研究以HIF-1α為靶點(diǎn)的肺癌基因治療具有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因沉默技術(shù)，已成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MiRNA質(zhì)粒的肺腺癌A549細(xì)胞株，通過(guò)構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步在體觀察HIF-1α基因沉默對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和survivin表達(dá)的影響。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，腫瘤組織細(xì)胞凋亡明顯增加，survivin mRNA和蛋白表達(dá)也顯著降低，與各對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HIF-1α基因沉默有效抑制移植瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加可能與survivin表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

survivin是凋亡抑制蛋白家族中相對(duì)分子量最小的成員，但也是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子[1]，其抗凋亡機(jī)制主要是通過(guò)直接或間接抑制Caspase活性而發(fā)揮抗凋亡作用，目前，有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[10]、胰腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]中的過(guò)表達(dá)的HIF-1α上調(diào)survivin表達(dá)，體外研究采用HIF-1α基因沉默導(dǎo)致survivin的表達(dá)下調(diào)，表明兩者存在顯著正相關(guān)，Chen和Kirito等[13，14]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α對(duì)Notch-1和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體誘導(dǎo)的survivin的表達(dá)有協(xié)調(diào)作用，表明HIF-1α在survivin的表達(dá)調(diào)控中起著非常重要的作用，Sun等[15]在胰腺癌的在體研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α和survivin的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，可能是由于體外的人工缺氧環(huán)境不能完全模擬實(shí)體瘤內(nèi)部的真實(shí)的缺氧條件，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體探討HIF-1α基因沉默對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及survivin表達(dá)的影響，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組survivin mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明HIF-1α基因沉默抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)可能部分原因是由于下調(diào)survivin表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加所致。

HIF-1α靶向治療現(xiàn)已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，臨床的應(yīng)用前景有賴于我們對(duì)于乏氧調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制更深人的理解，隨著人們對(duì)HIF-1α參與肺癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明，進(jìn)而可能以此為基礎(chǔ)開(kāi)辟肺癌基因治療的新途徑。

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