馬玉英 張朝霞 袁葆琳 陳素瓊

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展是多因素參與的極其復(fù)雜的過(guò)程。抑癌基因的失活是近年來(lái)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制中研究的熱點(diǎn)之一，而脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因和WW的結(jié)構(gòu)域(WW domain- containing oxidoreduc-tase，WWOX) 基因分別是活躍的第一和第二位脆性位點(diǎn)的抑癌基因,這些位點(diǎn)的斷裂、缺失和重排往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)脆性位點(diǎn)抑癌基因FHIT和WWOX在胃癌組織中的表達(dá),探討其與臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院、銀川市第一人民醫(yī)院2004～2006年經(jīng)病理檢查證實(shí)為胃癌的存檔蠟塊70例，其中男性51例,女性19例；年齡47～75歲，平均年齡52.5歲；高分化16例，中-低分化54例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)轉(zhuǎn)移32例；Ⅰ期7例，Ⅱ期16例，Ⅲ期28例，Ⅳ期19例。取相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織30例。

1.2 試劑

一抗：兔抗人WWOX多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司；兔抗人FHIT多克隆體，購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；PV-9000二步法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

采用PV-9000二步免疫組化法檢測(cè)FHIT和WWOX在胃癌組織、癌旁正常組織中的表達(dá)，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用PBS緩沖液代替一抗分別作陰性對(duì)照，用公司提供的FHIT和WWOX陽(yáng)性胃癌組織切片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

觀察FHIT和WWOX蛋白的分布、陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性率。由兩名病理科醫(yī)生采用盲法閱片，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)商統(tǒng)一評(píng)定最終結(jié)果。以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。參照文獻(xiàn)[1]記載判斷標(biāo)準(zhǔn)：每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率結(jié)果進(jìn)行分析：首先對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度記分：0分為無(wú)色；1分為弱陽(yáng)性(淡黃色)；2分為中度陽(yáng)性(棕黃色)；3分為強(qiáng)陽(yáng)性(棕褐色)；然后在對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：1分為陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤10%；2分為陽(yáng)性細(xì)胞占11%～50%；3分為陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%；4分為陽(yáng)性細(xì)胞百分率≥75%。結(jié)果取兩者評(píng)分之乘積，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比的乘積>3分為陽(yáng)性，乘積為0～3分判為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用檢驗(yàn)和Fisher確切概率法；兩指標(biāo)之間的相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 FHIT、WWOX蛋白在胃癌組織、癌旁正常組織中的表達(dá)情況

70例胃癌組織中FHIT、WWOX的陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.6%(20/70)、31.4%(20/70)，30例癌旁正常組織中FHIT、WWOX的陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.0%(21/30)、86.7%(26/30)，胃癌組織中的FHIT、WWOX陽(yáng)性表達(dá)率與癌旁正常組織中的表達(dá)率比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 胃癌組織中FHIT、WWOX蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

70例胃癌組織中FHIT、WWOX陽(yáng)性率，與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 FHIT和WWOX蛋白表達(dá)與胃癌組織臨床病理因素的關(guān)系(例，%)

2.3 胃癌組織中FHIT和WWOX表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，F(xiàn)HIT與WWOX表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01，γ=0.413)，見(jiàn)表2。

表2 胃癌組織中FHIT和WWOX表達(dá)的相關(guān)性 (例)

3 討論

近年來(lái)研究已證實(shí)脆性位點(diǎn)抑癌基因FHIT、WWOX分別在FRA3B、FRA16D部位的斷裂對(duì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展起到了重要的作用。

FHIT是Ohta等[2]在1996年發(fā)現(xiàn)的新的抑癌基因，該基因位于3pl4.2區(qū)，該基因編碼的蛋白質(zhì)與組氨酸三聯(lián)體(histidinetriad，HIT)的蛋白質(zhì)高度同源，故命名為脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)。FHIT基因結(jié)構(gòu)上有兩大特點(diǎn)：即跨越了脆性位點(diǎn)FRA3B和基因組中易位斷裂點(diǎn)t(3；8)，易發(fā)生斷裂[3]。研究發(fā)現(xiàn)，人體的所有組織都有表達(dá)FHIT基因，多種腫瘤都有FHIT基因的轉(zhuǎn)錄異常和FHIT蛋白的缺失或低表達(dá)，人工誘導(dǎo)FHIT蛋白的過(guò)表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)[4，5]。Huipin等[6]研究顯示，乳腺癌中FHIT蛋白的缺失與FHIT基因的LOH顯著相關(guān)，認(rèn)為是FHIT基因缺失導(dǎo)致了FHIT蛋白失表達(dá)。Dumon等[7]證明FHIT基因敲除鼠增加了散發(fā)性腫瘤的發(fā)病率。Mori等[8]用免疫組化法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織發(fā)現(xiàn)，在70%～79%的食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)缺失或下降。本研究從蛋白表達(dá)情況檢測(cè)了胃癌組織和癌旁正常組織中FHIT的表達(dá)，結(jié)果顯示：與癌旁正常組織比較，F(xiàn)HIT蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下調(diào)。提示FHIT在胃癌組織中表達(dá)與胃癌細(xì)胞的分化程度、腫瘤的浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等明顯相關(guān)，表明FHIT基因的上調(diào)起到抑制腫瘤的作用。

WWOX是2000年由Bednarek等[9]應(yīng)用鳥(niǎo)槍基因測(cè)序技術(shù)鑒別出的候選抑癌基因，定位于16q23.3～24.1，跨越FRA16D脆性位點(diǎn)。FRAI6D是第2位發(fā)現(xiàn)的較活躍的脆性位點(diǎn)，由9個(gè)外顯子組成，編碼含414個(gè)氨基酸的蛋白。WWOX蛋白的氨基末端有2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，WW功能域主要與蛋白之間相互作用有關(guān)，而蛋白與蛋白之間的相互作用，是機(jī)體抑癌基因通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)所必需。Nunez等[10]研究發(fā)現(xiàn)WWOX蛋白在卵巢癌中的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織。Park等[11]研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞株中WWOX基因頻繁發(fā)生突變，所有mRNA下調(diào)的細(xì)胞株都有WWOX蛋白的減少或缺失，提示W(wǎng)WOX基因的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有一定的密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示:與癌旁正常組織比較，WWOX蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下調(diào)。提示FHIT在胃癌組織中表達(dá)與胃癌細(xì)胞的分化程度、腫瘤的浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等明顯相關(guān)，表明WWOX蛋白的缺失或減少使癌細(xì)胞生長(zhǎng)加快。

本研究中，F(xiàn)HIT和WWOX在胃癌組織中的表達(dá)具有相關(guān)性，且與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，兩者之間有相互協(xié)同的關(guān)系，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究；FHIT及WWOX可能會(huì)成為新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)胃癌患者的治療及預(yù)后判斷有一定的價(jià)值。

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