方慧云 程偉民 李曉玲 季明芳

CIK細(xì)胞在體外經(jīng)CD3單克隆抗體和重組人白細(xì)胞介素-2、重組人白細(xì)胞介素-1植物凝集素、γ干擾素等誘導(dǎo)產(chǎn)生，在幾種細(xì)胞因子作用下有較強地增殖能力和明顯殺癌細(xì)胞的生物活性。本研究是將CIK細(xì)胞行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，回輸患者體內(nèi)，并隨機抽出20例未行CIK治療的非小細(xì)胞肺癌患者進行比較，觀察其生存期。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集20例經(jīng)確診的、并發(fā)生轉(zhuǎn)移的、采用標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療(手術(shù)、放療和化療)的非小細(xì)胞肺癌患者作為觀察組，取外周血分離單個核細(xì)胞(PBMC)，體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型，20例患者均接受CIK細(xì)胞免疫治療，觀察其免疫活性及生存期。以20例僅采用標(biāo)準(zhǔn)治療方案而未經(jīng)CIK治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者作為對照組。兩組性別、年齡無顯著差異。

1.2 主要試劑

GT-T551無血清培養(yǎng)基購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)用IL-2、CD3McAb、IL-1、IFN-γ均為R&D公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀標(biāo)記抗體CD3 、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+為BeckmanCoulter產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)

CIK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和擴增：采集患者外周血50 ml，用淋巴細(xì)胞分離液( Ficoll)分離出PBMNC，GT-T551無血清培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為(4 ～6 )×106/ml，并加入1 000 U /ml的IFN-γ懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液15 ml，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入1 μg/ml的CD3單克隆抗體和1 000 U /ml的IL-1,48 h后補加液至50 ml，補充CD3單克隆抗體。第4天繼續(xù)補加液至80 ml，培養(yǎng)第5天分成3瓶，第7天轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋，每2天加液1次，液量為500 ml。

1.4 CIK細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測

待細(xì)胞培養(yǎng)15天后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CIK細(xì)胞表面分子，CIK細(xì)胞是以CD3、CD4、CD8細(xì)胞為主的異質(zhì)性細(xì)胞，CD3 和CD8細(xì)胞百分率隨培養(yǎng)時間的延長而增高，CD3分辨率 >80%，CD3+CD56+分辨率 >20%。

1.5 治療方法

細(xì)胞培養(yǎng)第15天開始回輸患者體內(nèi)，細(xì)胞分5次回輸，細(xì)胞總量不少于1010。輸注過程中要嚴(yán)格按照無菌操作程序，沖洗輸液管道的鹽水量不必太多，輸前口服消炎痛，出現(xiàn)發(fā)熱寒戰(zhàn)等癥狀應(yīng)停止回輸，并采取應(yīng)對措施。每3～6個月復(fù)查腦CT、骨ECT。

統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用13.0 SPSS統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后細(xì)胞表型分析結(jié)果

患者淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后CD3、CD3+CD56+的表達百分率較高,見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者淋巴細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后細(xì)胞表型分析結(jié)果(±s，﹪)

免疫指標(biāo)檢測值參考值CD8+ 68．1±10．118．1～29．6CD4+ 24．6±8．525．8～41．6CD3+ 91．4±2．761．6～77．0CD8+CD28+ 23．4±7．28．6～15．5CD8+CD28? 28．0±9．89．9～24．8CD4+CD8+ 0．36±0．110．98～1．94CD28+ 56．5±8．939．5～64．8CD3?CD56+ 1．90±2．5CD3+CD56+ 39．2±9．5

2.2 預(yù)后情況

觀察組發(fā)生轉(zhuǎn)移后生存期為(16.15±3.8)個月，對照組生存期為(9.12±3.2)個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05) 。

3 討論

CIK細(xì)胞是1種新型的免疫活性細(xì)胞。它是將人外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞[1]，具有增殖速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高等優(yōu)點；配合化療、放療，可提高腫瘤患者對放化療的耐受性，提高腫瘤的治療效果；晚期腫瘤患者單純采用CIK治療，可以消除、減小腫瘤，提高患者免疫力、生存率以及生活質(zhì)量。

CIK細(xì)胞是多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，多種細(xì)胞因子的作用是相互協(xié)同，單一細(xì)胞因子對效應(yīng)細(xì)胞的增殖及細(xì)胞毒活性小于多種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用?？笴D3單克隆抗體(CD3McAb)作為1種有絲分裂促進劑可促進細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。γ-干擾素(IFN-γ)可通過多種途徑直接或間接發(fā)揮抗腫瘤作用。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成過程中加入IFN-γ可降低IL-2用量，且先加入IFN-γ后加入IL-1可提高細(xì)胞毒活性，因為先加入IFN-γ可促使PBMC上IL-2受體數(shù)量增加，從而有效地激活效應(yīng)細(xì)胞。白細(xì)胞介素-1(IL-1)主要由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它可以介導(dǎo)外周單個核細(xì)胞上表達IL-2受體，與IFN-γ、CD3McAb合用時可以明顯提高CIK的細(xì)胞毒效應(yīng)，但IL-1對CIK擴增不起作用[2，3]。白細(xì)胞介素-2(IL-2)是T淋巴細(xì)胞分泌的1種細(xì)胞因子，具有免疫增強、抗腫瘤和抗感染的作用。

CIK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞機制：與靶細(xì)胞結(jié)合階段，通過靶細(xì)胞表面分子和效應(yīng)細(xì)胞表面的受體相結(jié)合；致死性打擊階段，CIK細(xì)胞激活后釋放毒性顆粒和分泌細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解；靶細(xì)胞溶解階段。

本研究結(jié)果顯示，20例晚期肺癌患者通過CIK 治療后，其生存期較對照組(未進行CIK治療)明顯延長。目前，晚期肺癌患者在接受標(biāo)準(zhǔn)治療后，聯(lián)合細(xì)胞免疫治療，可改善患者生存質(zhì)量，提高生存率。

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