曾益華 王岳松 張世杰 胡愛民

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟的過程，在腫瘤的每個(gè)發(fā)展階段，都有不同的分子生物學(xué)改變。癌基因和抑癌基因失衡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的改變，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究旨在蛋白質(zhì)水平，檢測(cè)抑癌基因PTEN蛋白、MAPK信號(hào)、及周期素Cyclin D1在肺癌中的表達(dá)，從而在蛋白質(zhì)水平了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，為診斷肺癌、評(píng)估肺癌的預(yù)后和基因治療提供新的理論依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2005年～2010年空軍總醫(yī)院病理科肺癌手術(shù)切除標(biāo)本和纖維支氣管鏡(纖支鏡)肺癌活檢標(biāo)本共62例，肺癌癌旁組織36例，正常肺組織10例。肺癌根據(jù)WHO(2004)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型，其中鱗癌27 例，腺癌24 例，小細(xì)胞肺癌11 例。

1.2 抗體及試劑

PTEN、MPAK、Cyclin D1均為鼠抗人濃縮型單克隆抗體，為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。通用型SP試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)

所有標(biāo)本均經(jīng)10%的福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，并抗原修復(fù)，SP免疫組化染色。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

在光學(xué)顯微鏡下對(duì)切片染色情況進(jìn)行評(píng)估，免疫組化反應(yīng)以細(xì)胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，其判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：高倍鏡(40×10)下每張切片觀察5個(gè)視野，計(jì)算1 000個(gè)癌細(xì)胞，PTEN陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強(qiáng)陽性(++)。Cyclin D1陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強(qiáng)陽性(++)。MAPK陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強(qiáng)陽性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。各組記數(shù)資料的結(jié)果采用行×列表的檢驗(yàn)或四格表檢驗(yàn)，生存情況單因素分析采用Kaplan-meier方法，Wilcoxon檢驗(yàn)。多因素對(duì)生存的影響采用Cox回歸模型分析。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、MAPK和Cyclin D1表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系(表1)

表1 PTEN、 MAPK、Cyclin D1表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

2.1.1 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中PTEN表達(dá)及與其臨床病理因素的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示：PTEN陽性表達(dá)信號(hào)呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)。10例正常肺組織中PTEN均呈陽性，肺癌中PTEN蛋白陽性率[75.00%(47/62)]明顯低于癌旁組織[88.89%(32/36)]。PTEN蛋白陽性表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)(χ2=9.5017，P<0.01)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=5.6715，P<0.05)，非小細(xì)胞肺癌中PTEN陽性表達(dá)與腫瘤分化程度顯著相關(guān)，低分化癌組織中其呈強(qiáng)陽性，癌組織分化越低，PTEN陽性表達(dá)越弱。PTEN表達(dá)與患者年齡、性別均無明顯相關(guān)性，PTEN蛋白表達(dá)率不吸煙者顯著高于吸煙者，有顯著性差異(χ2=4.6177，P<0.05)。

2.1.2 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中MAPK表達(dá)及與其臨床病理因素的關(guān)系(表1) 免疫組化結(jié)果顯示：MAPK陽性表達(dá)信號(hào)呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)。10例正常肺組織中MAPK呈陰性表達(dá)，肺癌中其陽性率為33.87%(21/62)，高于癌旁組織[22.22%(8/36)]。MAPK陽性表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=5.3274，P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；低分化癌與中高分化癌其陽性率比較有顯著差異，低分化癌組織中MAPK呈強(qiáng)陽性表達(dá)，癌組織分化越差，MAPK表達(dá)越弱。MAPK表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙情況及腫瘤大小均無明顯相關(guān)性。

2.1.3 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中Cyclin D1表達(dá)及與其臨床病理因素的關(guān)系(表1) 免疫組化結(jié)果顯示：Cyclin D1陽性表達(dá)信號(hào)呈棕黃色，定位于細(xì)胞核。10例正常肺組織中Cyclin D1均呈陽性表達(dá)，肺癌中Cyclin D1蛋白陽性率為66.13%(41/62)，明顯低于癌旁組織[77.78%(28/36)]。Cyclin D1蛋白陽性率與患者吸煙情況顯著相關(guān)，吸煙者其陽性率顯著高于非吸煙者；N0與N1～3比較差異顯著，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Cyclin D1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無明顯相關(guān)性。

2.2 PTEN、MAPK 、Cyclin D1蛋白表達(dá)間的相關(guān)性

采用對(duì)數(shù)線性模型分析方法，分析PTEN、MAPK和Cyclin D1蛋白表達(dá)間的關(guān)系，結(jié)果顯示PTEN與MAPK表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)性，有顯著性差異(χ2=4.2250，P<0.05)，見表2。

表2 PTEN、 MAPK、Cyclin D1蛋白表達(dá)間相關(guān)性(例)

2.3 PTEN、MAPK 、CyclinD1蛋白表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)本組共30例可隨訪資料進(jìn)行多因素分析，共11個(gè)變量進(jìn)入Cox模型，包括PT、MAPK、CyclinD1、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類型、分化程度、性別、年齡和吸煙。采用逐步回歸法篩選上述變量，結(jié)果提示吸煙、腫瘤分化程度、PTEN及TNM分期4個(gè)列變量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.8045、8.1164、6.8165和6.9389，P均<0.05)；其危險(xiǎn)度分別為3.648、0.377、0.278和2.888，提示上述11個(gè)變量中吸煙(smoke)、分化程度(class)、PTEN及分期(fq)4個(gè)變量是本組的生存危險(xiǎn)因素。

2.3.1 PTEN表達(dá)與患者生存的關(guān)系 PTEN蛋白表達(dá)陽性者平均生存時(shí)間為25.9048個(gè)月，中位生存時(shí)間為24個(gè)月，陰性患者平均生存時(shí)間為17.7273個(gè)月，中位生存時(shí)間為17個(gè)月，PTEN表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，有顯著性差異，χ2=7.4296，P<0.05。

2.3.2 MAPK表達(dá)與患者生存的關(guān)系 MAPK蛋白表達(dá)陽性患者平均生存時(shí)間為25.3529個(gè)月，中位生存時(shí)間為23個(gè)月，陰性患者平均生存時(shí)間為20.5333個(gè)月，中位生存時(shí)間20個(gè)月，MAPK表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，但無顯著性差異，χ2=1.2540，P>0.05。

2.3.3 Cyclin D1表達(dá)與患者生存的關(guān)系 Cyclin D1蛋白表達(dá)陽性患者平均生存時(shí)間為24.1500個(gè)月，中位生存時(shí)間為22.5個(gè)月，陰性患者平均生存時(shí)間為20.8333個(gè)月，中位生存時(shí)間為18.00個(gè)月，Cyclin D1表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，但無顯著性差異，χ2=1.7988，P>0.05。

3 討論

3.1 PTEN蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達(dá)

PTEN[1～3]是新近發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)具有磷酸脂酶活性的腫瘤抑制基因，其特征類似于雙特異性磷酸酶，使酪氨酸和絲/蘇氨酸殘基磷酸化。PTEN正常表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)，PTEN基因突變、丟失，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)下降甚至完全不表達(dá)而使其抑癌功能喪失。國(guó)內(nèi)外PTEN與肺癌關(guān)系的研究已有報(bào)道，結(jié)果不完全一致[2,4]。

本研究結(jié)果顯示，正常肺組織PTEN蛋白表達(dá)全部呈陽性，說明正常肺組織無PTEN基因突變或缺失；而62例肺癌PTEN蛋白總陽性表達(dá)率為75.00%，明顯低于癌旁組織88.89%和正常肺組織，提示肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在PTEN基因的突變和(或)缺失，PTEN基因突變或缺失在肺癌中是一個(gè)常見事件，由于PTEN基因突變或缺失均能導(dǎo)致其蛋白表達(dá)陰性；從而導(dǎo)致其抑癌功能的喪失，本文PTEN蛋白陽性率結(jié)果略高于Cantley[2]和國(guó)內(nèi)學(xué)者竇鵬揮等[5]報(bào)道的，PTEN基因突變是否在非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌之間存在差異，國(guó)內(nèi)外研究也不一致，我們的結(jié)果顯示，PTEN突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌之間無顯著性差異，提示此兩型肺癌都有PTEN基因表達(dá)突變或缺失；本文結(jié)果還提示PTEN基因突變與腫瘤大小、吸煙及非小細(xì)胞肺癌分化程度有顯著性差異，提示腫瘤直徑超過5cm者PTEN突變機(jī)率增高，腫瘤越大，PTEN基因丟失越多，其抑癌功能也越差；通常認(rèn)為吸煙是肺癌的誘發(fā)因素之一，本文結(jié)果也證實(shí)了吸煙導(dǎo)致PTEN基因蛋白的丟失，可能是肺癌發(fā)生的誘因；細(xì)胞分化程度的高低決定腫瘤的惡性程度和預(yù)后，PTEN蛋白表達(dá)越低，腫瘤分化越差，預(yù)后越惡劣，由此提示，PTEN蛋白的高低可作為判斷肺癌預(yù)后的標(biāo)志。

3.2 MAPK蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達(dá)

從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是現(xiàn)代生物學(xué)的重要課題之一。PTEN參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)[1，6]，受體酪氨酸激酶-Ras-MAPK是將外界刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的最重要途徑之一。參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及分化等多種生理過程，并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用； MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，它在生長(zhǎng)因子和分化因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在未受刺激細(xì)胞內(nèi)，MAPK表現(xiàn)為脫磷酸型，只有當(dāng)它的蘇氨酸和酪氨酸殘基都被磷酸化后，MAPK才被激活。在人類MAP激酶(Erk1)磷酸化位點(diǎn)為202位的蘇氨酸和204位的酪氨酸，這些磷酸化位點(diǎn)被稱為MAPK的“TEY”特征順序，是MAPK的調(diào)節(jié)位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特征。

本研究結(jié)果顯示，正常肺組織中MAPK蛋白表達(dá)全部呈陰性，說明正常情況下肺組織無MAPK信號(hào)蛋白的激活，MAPK在肺癌中蛋白陽性率為33.87%，高于癌旁組織(22.22%)和正常肺組織，提示肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在MAPK信號(hào)基因的突變和(或)缺失，MAPK基因異常表達(dá)存在于肺癌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，由于MAPK基因異常表達(dá)導(dǎo)致其蛋白過度表達(dá)；從而引起MAPK信號(hào)激聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)異常激活，最終發(fā)生發(fā)展為肺癌；本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果MAPK表達(dá)陽性與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，N0與N1～3相比差異顯著，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；低分化癌與中高分化癌相比有顯著差異，低分化者M(jìn)APK在癌組織中呈強(qiáng)陽性，癌組織分化愈差，MAPK表達(dá)愈強(qiáng)。MAPK表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、性別、吸煙及大小均無明顯關(guān)系。由此提示MAPK表達(dá)的異?？勺鳛榉伟┑囊粋€(gè)預(yù)后判斷因素。

3.3 Cyclin D1蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達(dá)

細(xì)胞周期素D1基因定位于11q13，全長(zhǎng)15 kb，含有5個(gè)外顯子，編碼由295個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱Cyclin D1，其中第56～141位氨基酸序列為保守序列，稱周期素盒子(Cyclin box)。周期素盒子的主要功能是與CDK結(jié)合并激活之，如果該區(qū)域突變，Cyclin與CDK的結(jié)合能力和激活功能同時(shí)喪失。當(dāng)Cyclin D1型蛋白過表達(dá)或功能性減少時(shí)，G1期縮短，G1～S期進(jìn)程加速，可使細(xì)胞持續(xù)增加，最終形成腫瘤[7,8]。Cyclin與CDK的結(jié)合能力和激活功能同時(shí)喪失。當(dāng)Cyclin D1型蛋白過表達(dá)或功能性減少時(shí)，G1期縮短，G1～S期進(jìn)程加速，可使細(xì)胞持續(xù)增加，最終形成腫瘤[7,8]。

本研究結(jié)果顯示，10例正常肺組織均為Cyclin D1陽性，Cyclin D1在肺癌中蛋白總陽性率是66.13%(41/62)，與文獻(xiàn)報(bào)道的相近[8]；肺癌中Cyclin D1陽性率明顯低于癌旁組織[77.78%(28/36)]。Cyclin D1蛋白陽性率與吸煙情況顯著相關(guān)，吸煙者陽性率顯著高于非吸煙者；提示吸煙是肺癌的誘發(fā)因素；N0與N1～3相比差異顯著，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，由此說明Cyclin D1可作為判斷肺癌預(yù)后因素之一；Cyclin D1表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無明顯相關(guān)性。

3.4 PTEN、MAPK及Cyclin D1蛋白在肺癌中表達(dá)及相關(guān)性

PTEN對(duì)酸性底物有高度活性,磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)是PTEN的主要底物,FAK也是PTEN作用的主要底物，Shc是否為PTEN的底物目前尚有爭(zhēng)論；由此可知PTEN控制以下3條信號(hào)途徑[4,9]：①PTEN-FAK- p130Cas 骨架蛋白組裝、細(xì)胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移；②PTEN-PIP3-Akt-p27/CyclinD1 控制細(xì)胞周期； ③PTEN-Shc/- Grb2/Sos/ras - MAPK-Cyclin D1下調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)和周期控制。

本文應(yīng)用對(duì)數(shù)線性模型分析方法分析PTEN、MAPK和Cyclin D1蛋白三者間的關(guān)系，結(jié)果示PTEN和MAPK兩者呈明顯的負(fù)相關(guān)，有顯著性意義。表明PTEN蛋白能夠有效抑制Ras/Raf/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)途徑，提示在肺癌的發(fā)生中，可能由于PTEN蛋白表達(dá)降低或缺失，不能有效抑制由致癌因子異常激活的Ras/Raf/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而使肺癌癌細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化；此途徑的激活可能是PTEN蛋白失表達(dá)而不能使Shc脫磷酸所致；但PTEN是否直接使MAPK去磷酸化值得進(jìn)一步研究。

3.5 PTEN、MAPK及Cyclin D1表達(dá)與肺癌預(yù)后的關(guān)系

本文通過多個(gè)預(yù)后相關(guān)因子對(duì)肺癌患者的生存狀況的影響作了進(jìn)一步的研究。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)本組共30例可隨訪資料進(jìn)行多因素分析探討多個(gè)預(yù)后相關(guān)因子對(duì)生存狀況的影響。共11個(gè)列變量進(jìn)入Cox模型，包括PTEN、MAPK、Cyclin D1、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類型、分化程度、性別、年齡和吸煙。經(jīng)用逐步回歸法篩選上述變量后，吸煙、分化程度、PTEN及分期4個(gè)變量用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型可信度檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示上述11個(gè)變量中吸煙、分化程度、PTEN及分期4個(gè)變量是本組的生存危險(xiǎn)因素。

單因素分析采用Kaplan-Meier生存曲線與Wilcoxon檢驗(yàn)，PTEN蛋白表達(dá)陽性患者平均生存時(shí)間為25.9048個(gè)月，而PTEN蛋白表達(dá)陰性病例平均生存時(shí)間為17.7273個(gè)月，PTEN表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，Wilcoxon檢驗(yàn)，有顯著性差異。提示PTEN蛋白表達(dá)是1個(gè)有價(jià)值的、獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，PTEN蛋白失表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)。MAPK蛋白表達(dá)陽性病例平均生存時(shí)間為25.3529個(gè)月，陰性病例平均生存時(shí)間為20.5333個(gè)月，MAPK表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，但Wilcoxon檢驗(yàn)無顯著性差異；Cyclin D1蛋白表達(dá)陽性病例平均生存時(shí)間為24.1500個(gè)月，陰性病例平均生存時(shí)間為20.8333個(gè)月，Cyclin D1蛋白表達(dá)陰性患者較陽性患者生存時(shí)間短，但Wilcoxon檢驗(yàn)亦無顯著性差異。

總之，PTEN蛋白作為第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，自發(fā)現(xiàn)以來備受關(guān)注，我們認(rèn)為PTEN蛋白的丟失貫穿于肺癌發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程，肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在PTEN負(fù)調(diào)控MAPK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但PTEN如何影響Cyclin D1尚需作進(jìn)一步的探討，在臨床實(shí)踐中，可把PTEN、MAPK以及Cyclin D1作為診斷肺癌的參考因素，還可將其列為判斷病程是否進(jìn)展和評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)。

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