曾益華 王岳松 張世杰 胡愛民

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多步驟的過程，在腫瘤的每個發(fā)展階段，都有不同的分子生物學(xué)改變。癌基因和抑癌基因失衡、細胞信號傳導(dǎo)通路的異常、細胞周期調(diào)節(jié)的改變，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究旨在蛋白質(zhì)水平，檢測抑癌基因PTEN蛋白、MAPK信號、及周期素Cyclin D1在肺癌中的表達，從而在蛋白質(zhì)水平了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機理，為診斷肺癌、評估肺癌的預(yù)后和基因治療提供新的理論依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2005年～2010年空軍總醫(yī)院病理科肺癌手術(shù)切除標(biāo)本和纖維支氣管鏡(纖支鏡)肺癌活檢標(biāo)本共62例，肺癌癌旁組織36例，正常肺組織10例。肺癌根據(jù)WHO(2004)標(biāo)準(zhǔn)進行病理分型，其中鱗癌27 例，腺癌24 例，小細胞肺癌11 例。

1.2 抗體及試劑

PTEN、MPAK、Cyclin D1均為鼠抗人濃縮型單克隆抗體，為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。通用型SP試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測

所有標(biāo)本均經(jīng)10%的福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，并抗原修復(fù)，SP免疫組化染色。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 結(jié)果判定

在光學(xué)顯微鏡下對切片染色情況進行評估，免疫組化反應(yīng)以細胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，其判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：高倍鏡(40×10)下每張切片觀察5個視野，計算1 000個癌細胞，PTEN陽性細胞數(shù)<10%為陰性(-)，陽性細胞數(shù)11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強陽性(++)。Cyclin D1陽性細胞數(shù)<10%為陰性，11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強陽性(++)。MAPK陽性細胞數(shù)<10%為陰性(-)，陽性細胞數(shù)11%～50%為陽性(+)，51%～100%為強陽性(++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計學(xué)軟件包對所有數(shù)據(jù)進行處理。各組記數(shù)資料的結(jié)果采用行×列表的檢驗或四格表檢驗，生存情況單因素分析采用Kaplan-meier方法，Wilcoxon檢驗。多因素對生存的影響采用Cox回歸模型分析。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、MAPK和Cyclin D1表達與肺癌臨床病理因素的關(guān)系(表1)

表1 PTEN、 MAPK、Cyclin D1表達與肺癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

2.1.1 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中PTEN表達及與其臨床病理因素的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示：PTEN陽性表達信號呈棕黃色，定位于細胞質(zhì)。10例正常肺組織中PTEN均呈陽性，肺癌中PTEN蛋白陽性率[75.00%(47/62)]明顯低于癌旁組織[88.89%(32/36)]。PTEN蛋白陽性表達與腫瘤大小顯著相關(guān)(χ2=9.5017，P<0.01)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=5.6715，P<0.05)，非小細胞肺癌中PTEN陽性表達與腫瘤分化程度顯著相關(guān)，低分化癌組織中其呈強陽性，癌組織分化越低，PTEN陽性表達越弱。PTEN表達與患者年齡、性別均無明顯相關(guān)性，PTEN蛋白表達率不吸煙者顯著高于吸煙者，有顯著性差異(χ2=4.6177，P<0.05)。

2.1.2 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中MAPK表達及與其臨床病理因素的關(guān)系(表1) 免疫組化結(jié)果顯示：MAPK陽性表達信號呈棕黃色，定位于細胞質(zhì)。10例正常肺組織中MAPK呈陰性表達，肺癌中其陽性率為33.87%(21/62)，高于癌旁組織[22.22%(8/36)]。MAPK陽性表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=5.3274，P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；低分化癌與中高分化癌其陽性率比較有顯著差異，低分化癌組織中MAPK呈強陽性表達，癌組織分化越差，MAPK表達越弱。MAPK表達與患者年齡、性別、吸煙情況及腫瘤大小均無明顯相關(guān)性。

2.1.3 正常肺組織、肺癌及癌旁組織中Cyclin D1表達及與其臨床病理因素的關(guān)系(表1) 免疫組化結(jié)果顯示：Cyclin D1陽性表達信號呈棕黃色，定位于細胞核。10例正常肺組織中Cyclin D1均呈陽性表達，肺癌中Cyclin D1蛋白陽性率為66.13%(41/62)，明顯低于癌旁組織[77.78%(28/36)]。Cyclin D1蛋白陽性率與患者吸煙情況顯著相關(guān)，吸煙者其陽性率顯著高于非吸煙者；N0與N1～3比較差異顯著，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Cyclin D1表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無明顯相關(guān)性。

2.2 PTEN、MAPK 、Cyclin D1蛋白表達間的相關(guān)性

采用對數(shù)線性模型分析方法，分析PTEN、MAPK和Cyclin D1蛋白表達間的關(guān)系，結(jié)果顯示PTEN與MAPK表達呈明顯負相關(guān)性，有顯著性差異(χ2=4.2250，P<0.05)，見表2。

表2 PTEN、 MAPK、Cyclin D1蛋白表達間相關(guān)性(例)

2.3 PTEN、MAPK 、CyclinD1蛋白表達與患者生存期的關(guān)系

采用Cox比例風(fēng)險模型，對本組共30例可隨訪資料進行多因素分析，共11個變量進入Cox模型，包括PT、MAPK、CyclinD1、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類型、分化程度、性別、年齡和吸煙。采用逐步回歸法篩選上述變量，結(jié)果提示吸煙、腫瘤分化程度、PTEN及TNM分期4個列變量有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為6.8045、8.1164、6.8165和6.9389，P均<0.05)；其危險度分別為3.648、0.377、0.278和2.888，提示上述11個變量中吸煙(smoke)、分化程度(class)、PTEN及分期(fq)4個變量是本組的生存危險因素。

2.3.1 PTEN表達與患者生存的關(guān)系 PTEN蛋白表達陽性者平均生存時間為25.9048個月，中位生存時間為24個月，陰性患者平均生存時間為17.7273個月，中位生存時間為17個月，PTEN表達陰性患者較陽性患者生存時間短，有顯著性差異，χ2=7.4296，P<0.05。

2.3.2 MAPK表達與患者生存的關(guān)系 MAPK蛋白表達陽性患者平均生存時間為25.3529個月，中位生存時間為23個月，陰性患者平均生存時間為20.5333個月，中位生存時間20個月，MAPK表達陰性患者較陽性患者生存時間短，但無顯著性差異，χ2=1.2540，P>0.05。

2.3.3 Cyclin D1表達與患者生存的關(guān)系 Cyclin D1蛋白表達陽性患者平均生存時間為24.1500個月，中位生存時間為22.5個月，陰性患者平均生存時間為20.8333個月，中位生存時間為18.00個月，Cyclin D1表達陰性患者較陽性患者生存時間短，但無顯著性差異，χ2=1.7988，P>0.05。

3 討論

3.1 PTEN蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達

PTEN[1～3]是新近發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸脂酶活性的腫瘤抑制基因，其特征類似于雙特異性磷酸酶，使酪氨酸和絲/蘇氨酸殘基磷酸化。PTEN正常表達可以抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和生長，PTEN基因突變、丟失，導(dǎo)致其蛋白表達下降甚至完全不表達而使其抑癌功能喪失。國內(nèi)外PTEN與肺癌關(guān)系的研究已有報道，結(jié)果不完全一致[2,4]。

本研究結(jié)果顯示，正常肺組織PTEN蛋白表達全部呈陽性，說明正常肺組織無PTEN基因突變或缺失；而62例肺癌PTEN蛋白總陽性表達率為75.00%，明顯低于癌旁組織88.89%和正常肺組織，提示肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在PTEN基因的突變和(或)缺失，PTEN基因突變或缺失在肺癌中是一個常見事件，由于PTEN基因突變或缺失均能導(dǎo)致其蛋白表達陰性；從而導(dǎo)致其抑癌功能的喪失，本文PTEN蛋白陽性率結(jié)果略高于Cantley[2]和國內(nèi)學(xué)者竇鵬揮等[5]報道的，PTEN基因突變是否在非小細胞肺癌和小細胞肺癌之間存在差異，國內(nèi)外研究也不一致，我們的結(jié)果顯示，PTEN突變在非小細胞肺癌和小細胞肺癌之間無顯著性差異，提示此兩型肺癌都有PTEN基因表達突變或缺失；本文結(jié)果還提示PTEN基因突變與腫瘤大小、吸煙及非小細胞肺癌分化程度有顯著性差異，提示腫瘤直徑超過5cm者PTEN突變機率增高，腫瘤越大，PTEN基因丟失越多，其抑癌功能也越差；通常認為吸煙是肺癌的誘發(fā)因素之一，本文結(jié)果也證實了吸煙導(dǎo)致PTEN基因蛋白的丟失，可能是肺癌發(fā)生的誘因；細胞分化程度的高低決定腫瘤的惡性程度和預(yù)后，PTEN蛋白表達越低，腫瘤分化越差，預(yù)后越惡劣，由此提示，PTEN蛋白的高低可作為判斷肺癌預(yù)后的標(biāo)志。

3.2 MAPK蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達

從細胞表面到細胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是現(xiàn)代生物學(xué)的重要課題之一。PTEN參與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)[1，6]，受體酪氨酸激酶-Ras-MAPK是將外界刺激信號傳遞到細胞核內(nèi)的最重要途徑之一。參與細胞的生長、發(fā)育、分裂及分化等多種生理過程，并在細胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用； MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，它在生長因子和分化因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在未受刺激細胞內(nèi)，MAPK表現(xiàn)為脫磷酸型，只有當(dāng)它的蘇氨酸和酪氨酸殘基都被磷酸化后，MAPK才被激活。在人類MAP激酶(Erk1)磷酸化位點為202位的蘇氨酸和204位的酪氨酸，這些磷酸化位點被稱為MAPK的“TEY”特征順序，是MAPK的調(diào)節(jié)位點和結(jié)構(gòu)特征。

本研究結(jié)果顯示，正常肺組織中MAPK蛋白表達全部呈陰性，說明正常情況下肺組織無MAPK信號蛋白的激活，MAPK在肺癌中蛋白陽性率為33.87%，高于癌旁組織(22.22%)和正常肺組織，提示肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在MAPK信號基因的突變和(或)缺失，MAPK基因異常表達存在于肺癌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，由于MAPK基因異常表達導(dǎo)致其蛋白過度表達；從而引起MAPK信號激聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)異常激活，最終發(fā)生發(fā)展為肺癌；本文實驗結(jié)果MAPK表達陽性與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，N0與N1～3相比差異顯著，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；低分化癌與中高分化癌相比有顯著差異，低分化者MAPK在癌組織中呈強陽性，癌組織分化愈差，MAPK表達愈強。MAPK表達強度與患者年齡、性別、吸煙及大小均無明顯關(guān)系。由此提示MAPK表達的異?？勺鳛榉伟┑囊粋€預(yù)后判斷因素。

3.3 Cyclin D1蛋白在正常肺、癌旁和肺癌組織中的表達

細胞周期素D1基因定位于11q13，全長15 kb，含有5個外顯子，編碼由295個氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，簡稱Cyclin D1，其中第56～141位氨基酸序列為保守序列，稱周期素盒子(Cyclin box)。周期素盒子的主要功能是與CDK結(jié)合并激活之，如果該區(qū)域突變，Cyclin與CDK的結(jié)合能力和激活功能同時喪失。當(dāng)Cyclin D1型蛋白過表達或功能性減少時，G1期縮短，G1～S期進程加速，可使細胞持續(xù)增加，最終形成腫瘤[7,8]。Cyclin與CDK的結(jié)合能力和激活功能同時喪失。當(dāng)Cyclin D1型蛋白過表達或功能性減少時，G1期縮短，G1～S期進程加速，可使細胞持續(xù)增加，最終形成腫瘤[7,8]。

本研究結(jié)果顯示，10例正常肺組織均為Cyclin D1陽性，Cyclin D1在肺癌中蛋白總陽性率是66.13%(41/62)，與文獻報道的相近[8]；肺癌中Cyclin D1陽性率明顯低于癌旁組織[77.78%(28/36)]。Cyclin D1蛋白陽性率與吸煙情況顯著相關(guān)，吸煙者陽性率顯著高于非吸煙者；提示吸煙是肺癌的誘發(fā)因素；N0與N1～3相比差異顯著，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，由此說明Cyclin D1可作為判斷肺癌預(yù)后因素之一；Cyclin D1表達強度與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無明顯相關(guān)性。

3.4 PTEN、MAPK及Cyclin D1蛋白在肺癌中表達及相關(guān)性

PTEN對酸性底物有高度活性,磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)是PTEN的主要底物,FAK也是PTEN作用的主要底物，Shc是否為PTEN的底物目前尚有爭論；由此可知PTEN控制以下3條信號途徑[4,9]：①PTEN-FAK- p130Cas 骨架蛋白組裝、細胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移；②PTEN-PIP3-Akt-p27/CyclinD1 控制細胞周期； ③PTEN-Shc/- Grb2/Sos/ras - MAPK-Cyclin D1下調(diào)細胞生長和周期控制。

本文應(yīng)用對數(shù)線性模型分析方法分析PTEN、MAPK和Cyclin D1蛋白三者間的關(guān)系，結(jié)果示PTEN和MAPK兩者呈明顯的負相關(guān)，有顯著性意義。表明PTEN蛋白能夠有效抑制Ras/Raf/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)途徑，提示在肺癌的發(fā)生中，可能由于PTEN蛋白表達降低或缺失，不能有效抑制由致癌因子異常激活的Ras/Raf/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而使肺癌癌細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化；此途徑的激活可能是PTEN蛋白失表達而不能使Shc脫磷酸所致；但PTEN是否直接使MAPK去磷酸化值得進一步研究。

3.5 PTEN、MAPK及Cyclin D1表達與肺癌預(yù)后的關(guān)系

本文通過多個預(yù)后相關(guān)因子對肺癌患者的生存狀況的影響作了進一步的研究。采用Cox 比例風(fēng)險模型，對本組共30例可隨訪資料進行多因素分析探討多個預(yù)后相關(guān)因子對生存狀況的影響。共11個列變量進入Cox模型，包括PTEN、MAPK、Cyclin D1、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類型、分化程度、性別、年齡和吸煙。經(jīng)用逐步回歸法篩選上述變量后，吸煙、分化程度、PTEN及分期4個變量用Cox比例風(fēng)險模型可信度檢驗，有統(tǒng)計學(xué)意義，提示上述11個變量中吸煙、分化程度、PTEN及分期4個變量是本組的生存危險因素。

單因素分析采用Kaplan-Meier生存曲線與Wilcoxon檢驗，PTEN蛋白表達陽性患者平均生存時間為25.9048個月，而PTEN蛋白表達陰性病例平均生存時間為17.7273個月，PTEN表達陰性患者較陽性患者生存時間短，Wilcoxon檢驗，有顯著性差異。提示PTEN蛋白表達是1個有價值的、獨立的預(yù)后指標(biāo)，PTEN蛋白失表達與預(yù)后不良密切相關(guān)。MAPK蛋白表達陽性病例平均生存時間為25.3529個月，陰性病例平均生存時間為20.5333個月，MAPK表達陰性患者較陽性患者生存時間短，但Wilcoxon檢驗無顯著性差異；Cyclin D1蛋白表達陽性病例平均生存時間為24.1500個月，陰性病例平均生存時間為20.8333個月，Cyclin D1蛋白表達陰性患者較陽性患者生存時間短，但Wilcoxon檢驗亦無顯著性差異。

總之，PTEN蛋白作為第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，自發(fā)現(xiàn)以來備受關(guān)注，我們認為PTEN蛋白的丟失貫穿于肺癌發(fā)生發(fā)展的整個過程，肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在PTEN負調(diào)控MAPK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但PTEN如何影響Cyclin D1尚需作進一步的探討，在臨床實踐中，可把PTEN、MAPK以及Cyclin D1作為診斷肺癌的參考因素，還可將其列為判斷病程是否進展和評估預(yù)后的指標(biāo)。

[1]Li J,Yen C,Liow D,et al. Aputative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast and prostate cancer 〔J〕.Science， 1997,275(5308):1943.

[2]Cantley LC,Neel BG.New insights into tumor suppression:PTEN suppression tumor formation by restrainingthe phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway 〔J〕.PNAS，1999，96(8):4240.

[3]Jian-Min Tang,Quan-Ying He,Rui-Xia Guo,et al.Phosphorylated Akt overexpression and loss of PTEN expression in non-small cell lung cancer confers poor prognosis 〔J〕.Lung Cancer，2006，51：181.

[4]宋英華，李 玉，林曉燕.PTEN、P16和nm23-H1在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義〔J〕.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，30(10)：737.

[5]竇鵬揮.非小細胞肺癌中PTEN的表達及臨床意義〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(2):29.

[6]Qing-Bai She,David B Solit,Qing Ye,et al.The BAD protein integrates survival signaling by EGFR/MAPKand PI3K/Akt kinase pathways in PTEN-deficient tumor cells 〔J〕.Cancer Cell ，2005，8(10)：287.

[7]An HJ,Shim JY,Kim SJ,et al.Alteration of PTEN expression in endometrial carcinoma is associated with down-regulation of cyclin-dependent kinase inhibitor,p27 〔J〕.Histopathology，2002，41:437.

[8]謝 軍，何 云.非小細胞肺癌中Cyclin D1表達及臨床意義〔J〕.臨床肺科雜志，2010,15(4)：498.

[9]Tamura M,Gu J,Danen EH,et al.PTEN Interactions with focal adhesion kinnase and suppression of the extracellular matrix-dependent phosphatinositol 3-Kinase/akt cell survival pathway 〔J〕.J Biol Chem,1999,274:206.