楊伯平 侯茹蓉 任瑞美

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)自分泌途徑是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，針對EGFR的靶向藥物已顯示出良好的臨床療效。但Haddad等[1]發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR在大多數(shù)肺鱗狀細胞癌中都呈過表達，只有少數(shù)患者能從EGFR靶向治療中獲益。有研究顯示，上皮型的肺癌對EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治療較發(fā)生了間質(zhì)化改變的上皮細胞敏感，提示肺癌的上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換 (epithelial mesenchymal transition,EMT)狀態(tài)有望成為靶向治療療效的預(yù)測因素[2，3]。上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細胞在與周圍間質(zhì)的相互作用過程中逐漸獲得了某些間質(zhì)細胞特有性狀的現(xiàn)象，腫瘤細胞也因此獲得較強的侵襲和移動能力。 EMT 不僅包括細胞形態(tài)學(xué)的改變，還包括其基因型的改變，腫瘤細胞的代謝活性也因此發(fā)生了改變。本實驗構(gòu)建Snail擴增載體，并轉(zhuǎn)染SPCA-1細胞，觀察細胞發(fā)生EMT的改變，并在細胞水平上，研究非小細胞肺癌發(fā)生EMT前后3-脫氧-3-18F-氟代胸苷 (3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine,18F-FLT)的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake value,SUV)的改變，對特羅凱敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

SPCA-1細胞株由本實驗室保存，用含15%血清的DMEM中培養(yǎng)細胞，條件為5%CO2，溫度為37℃，每2～3天傳代1次。

1.2 pcDNA-Snai的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染提取人白細胞總RNA

采用RT-PCR方法擴增Snail基因全長，上下游引物為Forward primer：5'-aaagagcgcggcatagtgg-3'；Reverse primer：5'-tgctcaggatgtccccgctga-3'，在上下游引物中分別加入BamH I和Xba I位點。將克隆產(chǎn)物連接到pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建成pcDNA-Snail。采用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SPCA-1細胞株，并采用G 418進行篩選培養(yǎng)。

1.3 Western-blot 檢測轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細胞株中snail基因表達

倒去6個孔板中的培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，然后將200 μl細胞裂解液加入孔中(150 mM NaCl,50 mM Tris HCl,2 mM EDTA,0.5% Triton-X100,5mM DTT,0.2 mM PMSF H2O,Aprotinin)，20 min后收集，然后在4℃下13 000轉(zhuǎn)離心10 min，吸取上清液，沸水浴加熱上清液樣品變性3 min，制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，并點樣于膠中電泳1.5 h，在電轉(zhuǎn)膜儀上將凝膠中的樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上2 h左右，將硝酸纖維素濾膜于封閉液中4℃冰箱孵育過夜；將膜卷曲置于離心管中，PBS沖洗，在抗snail鼠單抗中共育30 min，TBS-T漂洗5 min 3次，用第二抗羊抗鼠抗體IgG溫育半小時，加入DAB顯色劑至陽性條帶顯色理想為止，在EDTA 緩沖液中終止顯色反應(yīng)。

1.4 免疫組化法檢測SPCA-1細胞株中E-cadherin、vimentin、EGFR的表達

將轉(zhuǎn)染1周后的細胞株與對照組SPCA-1細胞株接種于涂有多聚賴氨酸的玻片上，貼壁后，取出玻片，用預(yù)冷的丙酮固定細胞5 min，PBS沖洗3次，0.01%胰酶消化3 min，加入稀釋的一抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入二抗孵育30 min，PBS沖洗3次加入三抗孵育30 min，PBS沖洗3次后DAB顯色。計數(shù)1 000個肺癌細胞中陽性細胞數(shù),無陽性細胞為陰性(-)；陽性細胞數(shù)<1%為“+”；1%～10%為“++”；11%～50%為“+++”；>50%為“++++”[8]。

1.5 檢測SPCA-1細胞株中18F-FLT的攝取值

2個6孔板3 復(fù)孔，在2組細胞株中加入74 KBq的18F-FLT,并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)源，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。取出后置于冰上，快速取各孔的上清液分別滴入編號的試管中，用冷凍過的磷酸鹽緩沖液沖洗各孔，將沖洗液混入原孔的上清液中。收集各孔的細胞分別放入編號的試管中，與其上清液相對應(yīng)，應(yīng)用γ-counting well(SY-2021定標(biāo)器)計數(shù)細胞內(nèi)(cell in,Cin)和細胞外(cell out,Cout)的放射性[2],計算Cin和Cout的比值(Cin/Cout)，進行3次獨立實驗，采用臺盼藍拒染法檢測活性細胞數(shù)。

1.6 MTT法檢測erlotinib對細胞株的生長抑制作用

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 表達載體pcDNA3.1- snail質(zhì)粒(圖1)

2.2 Wenstern-bloting 檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細胞株中snail基因表達見圖2。

圖2 Western blot檢測結(jié)果

2.3 免疫組化結(jié)果

E-cadherin陽性細胞為細胞膜呈棕黃色染色，vimentin陽性細胞為胞質(zhì)呈棕黃色染色，EGFR陽性細胞為胞質(zhì)呈片狀或顆粒狀棕黃色染色,實驗組細胞株中E-cadherin表達水平較對照組下降，vimentin表達水平較對照組下降,均有統(tǒng)計學(xué)差異,EGFR表達水平無明顯變化。

2.4 實驗組和對照組細胞株18F-FLT的攝取值

實驗組和對照組細胞株內(nèi)加入74 KBq的18F-FLT,并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)源，3個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。實驗組細胞株的攝取值[( 4.8±0.5)%]，高于對照組細胞株[(2.3±0.5)%]，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.003。

2.5 MTT法檢測erlotinib對實驗組和對照組細胞株的生長抑制作用

實驗組細胞株抑制率為(20.6%±3%)，明顯低于對照組細胞株(50%±2%)，P=0.008。

3 討論

目前在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發(fā)現(xiàn)EGFR過表達。Haddad等[1]研究也發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR在大多數(shù)頭頸部鱗狀細胞癌中都有過表達，但只有少數(shù)患者能從EGFR抗體治療中獲益。

另有研究發(fā)現(xiàn)對特羅凱(erlotinib)敏感的細胞E-cadherin具有較高的表達水平，且浸潤和轉(zhuǎn)移能力較低，相反對erlotinib抗拒的細胞，E-cadherin表達水平低，且浸潤和轉(zhuǎn)移能力強，因此，E-cadherin有可能成為判斷EGFR活性和靶向EGFR藥物治療療效的生物學(xué)指標(biāo)之一[3]。Fuchs等[4]根據(jù)E-cadherin和Vimentin的表達不同將12種細胞株分為上皮型和間質(zhì)型，研究發(fā)現(xiàn)上皮型細胞對靶向EGFR的治療各種藥物均敏感，而間質(zhì)型往往表現(xiàn)為抗拒且易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

EMT的概念改變了上皮細胞一成不變的觀念，認為上皮細胞是一群具有高度可塑性的細胞。而調(diào)控上皮細胞進行EMT的動力，主要是來自于與上皮細胞有密切交互作用的細胞黏附分子，其中以鈣黏蛋白(E-cadherin)一類的細胞黏附分子的調(diào)控最為重要。Eastham等[5]以干細胞為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人類胚胎干細胞的分化程度主要決定于E-cadherin和N-cadherin的轉(zhuǎn)變，增加vimentin 表達，上調(diào)E-cadherin抑制分子，細胞會出現(xiàn)運動，如果用抗體破壞介導(dǎo)干細胞之間互相連接的E-cadherin，細胞也會出現(xiàn)移動，細胞之間的有序結(jié)構(gòu)消失出現(xiàn)間質(zhì)變的現(xiàn)象。Lang等[6]認為vimentin表達參與調(diào)控上皮細胞的運動,在需要細胞移動的生理(如修復(fù))及病理過程(如腫瘤轉(zhuǎn)移)中上皮細胞往往表達vimentin 。Rho等[7]用腫瘤生長因子(TGF-beta1)作用肺鱗癌細胞株(A549)72h后出現(xiàn)EMT的改變，而去掉TGF-beta1后細胞回到以前的狀態(tài)。另有研究發(fā)現(xiàn)對特羅凱敏感的細胞E-cadherin具有較高的表達水平，且浸潤和轉(zhuǎn)移能力較低，相反對特羅凱抗拒的細胞，E-cadherin表達水平低，且浸潤和轉(zhuǎn)移能力強，因此，EMT是細胞的1種狀態(tài)，如有非創(chuàng)性的手段發(fā)現(xiàn)細胞組織處的狀態(tài)，將對指導(dǎo)靶向EGFR藥物治療提供理論依據(jù)。

Kudo-Saito等[8]研究發(fā)現(xiàn)Snail基因是調(diào)控EMT的主要基因。本研究發(fā)現(xiàn)，擴增Snail后，E-cadherin表達降低，vimentin表達升高，即細胞發(fā)生EMT改變。同時細胞的形態(tài)發(fā)生了改變，細胞變得細長，細胞融合度降低，并且MTT法結(jié)果顯示細胞對特羅凱的敏感性降低。在體內(nèi)病變的組織器官出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化之前，18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)(18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography,18F-FDG- PET)可從分子水平檢測和識別所發(fā)生的代謝改變。用PET檢查腫瘤的代謝，已有很多報道，18F-FLT被認為是反映腫瘤細胞增殖的1種新型示蹤劑，Atkinson 等[9]結(jié)果顯示，erlotinib應(yīng)用3天后，SUV下降18%，安慰劑組下降1%。在鱗狀細胞移植瘤檢測西妥昔單抗(cetuximab)的療效，cetuximab應(yīng)用后1周，SUV下降62%，安慰劑組下降16%。因此認為，18F-FLT-PET可以早期檢測腫瘤對靶向EGFR治療的反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示，細胞發(fā)生EMT改變后，對18F-FLT的攝取增加。

本研究從細胞水平，探討了E-cadherin、vimentin、EGFR表達的變化和18F-FLT的SUV等指標(biāo)與腫瘤對erlotinib的敏感性的關(guān)系，為應(yīng)用功能影像進行非小細胞肺癌靶向治療的個體化選擇提供理論基礎(chǔ),以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

[1]Haddad Y,Choi W,McConkey DJ.Delta-crystallin enhancer binding factor 1 controls the epithelial to mesenchymal transition phenotype and resistance to the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human head and neck squamous cell carcinoma lines〔J〕.Clin Cancer Res，2009,15(2):532.

[2]Thomson S,Buck E,Petti F,et al.Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition〔J〕.Cancer Res,2005,65(20):9455.

[3]Yauch RL,Januario T,Eberhard DA,et al.Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(24):8686.

[4]Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,et al.Epithelial-to-mesench-ymal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells〔J〕.Cancer Res,2008,68(7):2391.

[5]Eastham AM,Spencer H,Soncin F,et al.Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation〔J〕.Cancer Res,2007,67(23):11254.

[6]Lang SH,Hyde C,Reid IN,et al.Enhanced expression of vimentin in motile prostatecell lines and in poorly differentiated and metastatic prostate carcinoma〔J〕.Prostate,2002，52：253

[7]Rho JK,Choi YJ,Lee JK,et al.Epithelial to mesenchymal transition derived from repeated exposure to gefitinib determines the sensitivity to EGFR inhibitors in A549,a non-small cell lung cancer cell line〔J〕.Lung Cancer,2009,63(2):219.

[8]Kudo-Saito C,Shirako H,Takeuchi T,et al.Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells〔J〕.Cancer Cell,2009，15(3):195.

[9]Atkinson DM,Clarke MJ,Mladek AC,et al.Using fluorodeoxythymidine to monitor anti-EGFR inhibitor therapy in squamous cell carcinoma xenografts〔J〕.Head and Neck，2008,30(6):790.