楊伯平 侯茹蓉 任瑞美

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)自分泌途徑是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，針對(duì)EGFR的靶向藥物已顯示出良好的臨床療效。但Haddad等[1]發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR在大多數(shù)肺鱗狀細(xì)胞癌中都呈過(guò)表達(dá)，只有少數(shù)患者能從EGFR靶向治療中獲益。有研究顯示，上皮型的肺癌對(duì)EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治療較發(fā)生了間質(zhì)化改變的上皮細(xì)胞敏感，提示肺癌的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換 (epithelial mesenchymal transition,EMT)狀態(tài)有望成為靶向治療療效的預(yù)測(cè)因素[2，3]。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞在與周圍間質(zhì)的相互作用過(guò)程中逐漸獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞特有性狀的現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞也因此獲得較強(qiáng)的侵襲和移動(dòng)能力。 EMT 不僅包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，還包括其基因型的改變，腫瘤細(xì)胞的代謝活性也因此發(fā)生了改變。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建Snail擴(kuò)增載體，并轉(zhuǎn)染SPCA-1細(xì)胞，觀察細(xì)胞發(fā)生EMT的改變，并在細(xì)胞水平上，研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT前后3-脫氧-3-18F-氟代胸苷 (3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine,18F-FLT)的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake value,SUV)的改變，對(duì)特羅凱敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SPCA-1細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含15%血清的DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞，條件為5%CO2，溫度為37℃，每2～3天傳代1次。

1.2 pcDNA-Snai的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染提取人白細(xì)胞總RNA

采用RT-PCR方法擴(kuò)增Snail基因全長(zhǎng)，上下游引物為Forward primer：5'-aaagagcgcggcatagtgg-3'；Reverse primer：5'-tgctcaggatgtccccgctga-3'，在上下游引物中分別加入BamH I和Xba I位點(diǎn)。將克隆產(chǎn)物連接到pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建成pcDNA-Snail。采用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SPCA-1細(xì)胞株，并采用G 418進(jìn)行篩選培養(yǎng)。

1.3 Western-blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細(xì)胞株中snail基因表達(dá)

倒去6個(gè)孔板中的培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，然后將200 μl細(xì)胞裂解液加入孔中(150 mM NaCl,50 mM Tris HCl,2 mM EDTA,0.5% Triton-X100,5mM DTT,0.2 mM PMSF H2O,Aprotinin)，20 min后收集，然后在4℃下13 000轉(zhuǎn)離心10 min，吸取上清液，沸水浴加熱上清液樣品變性3 min，制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，并點(diǎn)樣于膠中電泳1.5 h，在電轉(zhuǎn)膜儀上將凝膠中的樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上2 h左右，將硝酸纖維素濾膜于封閉液中4℃冰箱孵育過(guò)夜；將膜卷曲置于離心管中，PBS沖洗，在抗snail鼠單抗中共育30 min，TBS-T漂洗5 min 3次，用第二抗羊抗鼠抗體IgG溫育半小時(shí)，加入DAB顯色劑至陽(yáng)性條帶顯色理想為止，在EDTA 緩沖液中終止顯色反應(yīng)。

1.4 免疫組化法檢測(cè)SPCA-1細(xì)胞株中E-cadherin、vimentin、EGFR的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染1周后的細(xì)胞株與對(duì)照組SPCA-1細(xì)胞株接種于涂有多聚賴氨酸的玻片上，貼壁后，取出玻片，用預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞5 min，PBS沖洗3次，0.01%胰酶消化3 min，加入稀釋的一抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入二抗孵育30 min，PBS沖洗3次加入三抗孵育30 min，PBS沖洗3次后DAB顯色。計(jì)數(shù)1 000個(gè)肺癌細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%為“+”；1%～10%為“++”；11%～50%為“+++”；>50%為“++++”[8]。

1.5 檢測(cè)SPCA-1細(xì)胞株中18F-FLT的攝取值

2個(gè)6孔板3 復(fù)孔，在2組細(xì)胞株中加入74 KBq的18F-FLT,并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)源，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。取出后置于冰上，快速取各孔的上清液分別滴入編號(hào)的試管中，用冷凍過(guò)的磷酸鹽緩沖液沖洗各孔，將沖洗液混入原孔的上清液中。收集各孔的細(xì)胞分別放入編號(hào)的試管中，與其上清液相對(duì)應(yīng)，應(yīng)用γ-counting well(SY-2021定標(biāo)器)計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)(cell in,Cin)和細(xì)胞外(cell out,Cout)的放射性[2],計(jì)算Cin和Cout的比值(Cin/Cout)，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)活性細(xì)胞數(shù)。

1.6 MTT法檢測(cè)erlotinib對(duì)細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pcDNA3.1- snail質(zhì)粒(圖1)

2.2 Wenstern-bloting 檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細(xì)胞株中snail基因表達(dá)見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 免疫組化結(jié)果

E-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜呈棕黃色染色，vimentin陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)呈棕黃色染色，EGFR陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)呈片狀或顆粒狀棕黃色染色,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株中E-cadherin表達(dá)水平較對(duì)照組下降，vimentin表達(dá)水平較對(duì)照組下降,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,EGFR表達(dá)水平無(wú)明顯變化。

2.4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞株18F-FLT的攝取值

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞株內(nèi)加入74 KBq的18F-FLT,并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)源，3個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株的攝取值[( 4.8±0.5)%]，高于對(duì)照組細(xì)胞株[(2.3±0.5)%]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.003。

2.5 MTT法檢測(cè)erlotinib對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株抑制率為(20.6%±3%)，明顯低于對(duì)照組細(xì)胞株(50%±2%)，P=0.008。

3 討論

目前在多種實(shí)體瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發(fā)現(xiàn)EGFR過(guò)表達(dá)。Haddad等[1]研究也發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR在大多數(shù)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中都有過(guò)表達(dá)，但只有少數(shù)患者能從EGFR抗體治療中獲益。

另有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)特羅凱(erlotinib)敏感的細(xì)胞E-cadherin具有較高的表達(dá)水平，且浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力較低，相反對(duì)erlotinib抗拒的細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)水平低，且浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，因此，E-cadherin有可能成為判斷EGFR活性和靶向EGFR藥物治療療效的生物學(xué)指標(biāo)之一[3]。Fuchs等[4]根據(jù)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)不同將12種細(xì)胞株分為上皮型和間質(zhì)型，研究發(fā)現(xiàn)上皮型細(xì)胞對(duì)靶向EGFR的治療各種藥物均敏感，而間質(zhì)型往往表現(xiàn)為抗拒且易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

EMT的概念改變了上皮細(xì)胞一成不變的觀念，認(rèn)為上皮細(xì)胞是一群具有高度可塑性的細(xì)胞。而調(diào)控上皮細(xì)胞進(jìn)行EMT的動(dòng)力，主要是來(lái)自于與上皮細(xì)胞有密切交互作用的細(xì)胞黏附分子，其中以鈣黏蛋白(E-cadherin)一類的細(xì)胞黏附分子的調(diào)控最為重要。Eastham等[5]以干細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人類胚胎干細(xì)胞的分化程度主要決定于E-cadherin和N-cadherin的轉(zhuǎn)變，增加vimentin 表達(dá)，上調(diào)E-cadherin抑制分子，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)，如果用抗體破壞介導(dǎo)干細(xì)胞之間互相連接的E-cadherin，細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)移動(dòng)，細(xì)胞之間的有序結(jié)構(gòu)消失出現(xiàn)間質(zhì)變的現(xiàn)象。Lang等[6]認(rèn)為vimentin表達(dá)參與調(diào)控上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),在需要細(xì)胞移動(dòng)的生理(如修復(fù))及病理過(guò)程(如腫瘤轉(zhuǎn)移)中上皮細(xì)胞往往表達(dá)vimentin 。Rho等[7]用腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF-beta1)作用肺鱗癌細(xì)胞株(A549)72h后出現(xiàn)EMT的改變，而去掉TGF-beta1后細(xì)胞回到以前的狀態(tài)。另有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)特羅凱敏感的細(xì)胞E-cadherin具有較高的表達(dá)水平，且浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力較低，相反對(duì)特羅凱抗拒的細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)水平低，且浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，因此，EMT是細(xì)胞的1種狀態(tài)，如有非創(chuàng)性的手段發(fā)現(xiàn)細(xì)胞組織處的狀態(tài)，將對(duì)指導(dǎo)靶向EGFR藥物治療提供理論依據(jù)。

Kudo-Saito等[8]研究發(fā)現(xiàn)Snail基因是調(diào)控EMT的主要基因。本研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增Snail后，E-cadherin表達(dá)降低，vimentin表達(dá)升高，即細(xì)胞發(fā)生EMT改變。同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞融合度降低，并且MTT法結(jié)果顯示細(xì)胞對(duì)特羅凱的敏感性降低。在體內(nèi)病變的組織器官出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化之前，18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)(18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography,18F-FDG- PET)可從分子水平檢測(cè)和識(shí)別所發(fā)生的代謝改變。用PET檢查腫瘤的代謝，已有很多報(bào)道，18F-FLT被認(rèn)為是反映腫瘤細(xì)胞增殖的1種新型示蹤劑，Atkinson 等[9]結(jié)果顯示，erlotinib應(yīng)用3天后，SUV下降18%，安慰劑組下降1%。在鱗狀細(xì)胞移植瘤檢測(cè)西妥昔單抗(cetuximab)的療效，cetuximab應(yīng)用后1周，SUV下降62%，安慰劑組下降16%。因此認(rèn)為，18F-FLT-PET可以早期檢測(cè)腫瘤對(duì)靶向EGFR治療的反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示，細(xì)胞發(fā)生EMT改變后，對(duì)18F-FLT的攝取增加。

本研究從細(xì)胞水平，探討了E-cadherin、vimentin、EGFR表達(dá)的變化和18F-FLT的SUV等指標(biāo)與腫瘤對(duì)erlotinib的敏感性的關(guān)系，為應(yīng)用功能影像進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌靶向治療的個(gè)體化選擇提供理論基礎(chǔ),以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

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