熊志紅 李仁德 朱 琰

Smads蛋白是生長轉(zhuǎn)化因子(transforming growth factorβ，TGF-β)的胞質(zhì)遞質(zhì)，在TGF-β信號傳導(dǎo)通路中起重要的調(diào)解作用。其中Smad2參與TGF-β/ activins 信號途徑，能調(diào)控其下游多種基因的表達。眾多研究表明，Smad2蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、腫瘤血管形成及播散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。小RNA干擾(small interfering RNA,siRNA)是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。我們通過構(gòu)建smad2基因特異性siRNA真核表達載體，檢測其對宮頸癌細胞HeLa中smad2基因的沉默作用，為研究Smad2 與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購于杭州四季青公司，Psilencer 2.1-U6-neo表達載體購于Ambion公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 為Invitrogen公司產(chǎn)品，鼠抗人Smad2多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG及抗Flag抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，限制性DNA內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ和T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品，小量質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于Axygen公司?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司。Smad2特異性siRNA寡核苷酸鏈合成和DNA序列測定，由上海生物公司完成。Flag-smad 2、3、4真核表達載體由本實驗室構(gòu)建，大腸桿菌E.coli DH5α、293T細胞和HeLa宮頸癌細胞由本實驗室保存。

1.2 smad2特異性siRNA的設(shè)計

以smad2基因編碼區(qū)序列為分析序列，使用Ambion公司網(wǎng)上提供的siRNA設(shè)計軟件，尋找其上2個相鄰的腺嘌呤核苷酸序列(AA)，這2個AA和緊隨其后的19個核苷酸成為潛在的siRNA靶位點。通過對基因序列和二級結(jié)構(gòu)的綜合分析，確定了2 條特異性寡核苷酸，并由此設(shè)計了兩條smad2發(fā)卡siRNA。siRNA1 正義鏈為：5′-CAGAACTTCCGCCTCTGGA-3′,反義鏈為：5′-TCCAGAGGCGGAAGTT CTG-3′；siRNA2 正義鏈為：5′-CCTGCATTTTGGTGTTCGA-3′,反義鏈為：5′-TCGAACACC AAAATGCAGG-3′。發(fā)卡siRNA包含了上述靶位點的19個堿基及其互補序列，靶序列與互補序列之間由9個堿基(TTCAAGAGA)組成的環(huán)隔開，5′和3′端分別含BamHI、HindⅢ酶切位點的黏性末端。

1.3 smad2 siRNA表達載體的構(gòu)建

參照Ambion公司的使用說明書，各取對應(yīng)的siRNA的正義鏈和反義鏈，在退火緩沖液中，于95℃水浴處理5 min，然后自然冷卻至室溫；將退火后的雙鏈siRNA模板與經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的siRNA表達載體pSliencer 2.1-U6，16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞；在氨芐青霉素抗性平板上篩選重組載體；BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒樣品送上海生工公司進行DNA序列分析。

1.4 質(zhì)粒DNA的制備、純化及定量

應(yīng)用Axygen的質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取smad2 siRNA1、2重組質(zhì)粒及Flag-smad2、Flag-smad3、Flag-smad4重組質(zhì)粒。應(yīng)用分光光度計檢測，要求質(zhì)粒的A260 nm與A280 nm比值大于1.8，經(jīng)瓊脂糖電泳觀察無任何降解的DNA，可用于細胞的轉(zhuǎn)染。根據(jù)A260 nm值計算質(zhì)粒的濃度。

1.5 smad2 siRNA質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的Hela細胞，用DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)轉(zhuǎn)種到24 孔板中，每孔0.5 mL，置于5%CO2孵箱內(nèi)，37℃常規(guī)培養(yǎng)，36 h 后即用Lipofectamine 2000 將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞。分別將0.5 μg 質(zhì)粒或混合質(zhì)粒與1.6 μL Lipofectamine 2 000，分別溶于50 μL 不含血清及抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中，之后將兩者混合，室溫放置20 min 后加入到含0.5 mL 10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基的24 孔細胞中。

1.6 Western blotting檢測細胞中內(nèi)源及外源Smad2的蛋白表達

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按常規(guī)方法收集細胞，加入適量RIPA 裂解液，超聲破碎，于4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。樣品經(jīng)SDS-PAGE 后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入抗Smad2的多克隆抗體，室溫結(jié)合1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，再加入兔抗鼠IGg抗體，室溫結(jié)合1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色5 min，X膠片壓片顯影，或用辣根過氧化酶偶聯(lián)的FLAG抗體，同上檢測蛋白中FLAG標(biāo)簽蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 smad2發(fā)卡siRNAs表達載體的設(shè)計及構(gòu)建

應(yīng)用siRNA設(shè)計軟件，在smad2基因的編碼區(qū)中尋找2個相鄰的腺嘌呤核苷酸序列(AA),其后緊隨的19個核苷酸為潛在的siRNA靶位點；經(jīng)Blast分析，選擇與其他分子無同源性的序列，且G+C含量接近50%。據(jù)此本實驗設(shè)計了2個smad2發(fā)卡siRNA的序列，該序列包含siRNA靶點的19個堿基及其互補序列,靶序列與互補序列之間由9個堿基組成的環(huán)隔開，兩端分別為BamHI、Hind Ⅲ的黏性末端。

化學(xué)合成的單鏈siRNA為線狀,一對互補的siRNA單鏈經(jīng)退火后形成發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，且兩端含BamHI、Hind Ⅲ的黏性末端，在連接酶的作用下，便可插入到同樣BamHI和HindⅢ雙酶切處理的siRNA表達載體pSliencer 2.1-U6 neo中。將酶切鑒定正確的2個siRNA重組質(zhì)粒，使用siRNA表達載體pSliencer 2.1-U6 neo的上游通用測序引物M13F，進行插入片段的序列分析，結(jié)果表明均獲得了插入的siRNA片段，且序列與預(yù)先的設(shè)計完全相符(測序圖略)。表明smad2 siRNA1，smad2 siRNA2表達載體均構(gòu)建成功。

2.2 smad2 siRNAs對外源smad2基因表達的影響

將帶有FLAG標(biāo)簽的smad2重組質(zhì)粒,分別與構(gòu)建好的2個siRNA重組質(zhì)粒、試劑盒提供的與已知的人基因組序列同源性極低的陰性對照siRNA載體，共轉(zhuǎn)染293T細胞。72 h后收集細胞裂解物，應(yīng)用FLAG抗體進行Western-blot分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA對照組相比,轉(zhuǎn)染smad2 siRNA1、2組均能明顯抑制細胞中FLAG-smad2融合基因的表達,Smad2蛋白表達水平僅為陰性對照組的20%，而同時檢測的內(nèi)參GAPDH蛋白表達無明顯改變(圖1)。

圖1 Smad2 siRNA對外源性Smad2蛋白表達的抑制

1為293T(FLAG-smad2)，2為293T(FLAG-smad2+siRNA1)，3為293T(FLAG-smad2+siRNA2)

2.3 smad2 siRNAs抑制smad2基因表達的特異性分析

由于smad2與smad3之間有一定的同源性，因此，我們進行了smad2 siRNA1對smad2、smad3、4沉默效應(yīng)的特異性分析。將帶有FLAG標(biāo)簽的smad2、smad3、smad4重組質(zhì)粒,分別與構(gòu)建好的smad2 siRNA重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。72 h后同樣用FLAG抗體對細胞裂解物進行Western-blot分析,結(jié)果顯示smad2 siRNA僅抑制smad2表達，而對其他smad家族蛋白的表達無影響(圖2) 。

圖2 Smad2 siRNA特異性抑制Smad2蛋白表達

1為293T(Flag-smad2)，2為293T(Flag-smad2+siRNA1)，3為293T(Flag-smad3)，4為293T(Flag-smad3+siRNA1)，5為293T(Flag-smad4)，6為293T(Flag-smad4+siRNA1)

2.4 smad2 siRNAs對內(nèi)源smad2基因表達的影響

在HeLa細胞中只轉(zhuǎn)染smad2 siRNAs及siRNA陰性對照載體,應(yīng)用smad2抗體進行Western-blot分析，結(jié)果表明smad2 siRNAs可以抑制內(nèi)源smad2表達，Smad2蛋白表達水平僅為陰性對照組的30%(圖3)。由此可見,所設(shè)計的smad2基因siRNA能有效降低腫瘤細胞中內(nèi)源性smad2基因的表達。

圖3 Smad2 siRNA抑制HeLa細胞中內(nèi)源性Smad2蛋白表達

1為HeLa cells裂解物，2為HeLa cells轉(zhuǎn)染smad2 siRNA后的裂解物

3 討論

siRNA技術(shù)能利用外源導(dǎo)入的雙鏈RNA(dsRNA)抑制細胞內(nèi)同源mRNA降解，有效、特異地抑制細胞內(nèi)特定基因的表達。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，siRNA技術(shù)投入少、周期短和操作簡便，并具有高特異性和抑制率兩大明顯優(yōu)勢[1]。siRNA抑制基因表達率極高，有的甚至可以完全阻斷基因表達，效果接近基因敲除技術(shù)，從而成為人們廣泛運用于研究基因的功能或基因治療的重要手段[2]。

Smads家族有9種亞型(Smad1-9)，是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中1個重要的基因家族[3]。其中smad2與smad3均為受體型分子，是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的第一信號分子[4]，能磷酸化后與其他受體型或調(diào)節(jié)型smad分子組成異聚體，進入細胞核，從而啟動一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡及分化等多種細胞程序[5]。smads基因突變或功能失活在人類腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用，但由于腫瘤發(fā)生的多因素性及TGF-β信號通路的復(fù)雜性，在不同的惡性腫瘤中其機制有所不同,一般認(rèn)為在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對腫瘤生長呈抑制作用；但對進展型和晚期腫瘤呈促進作用，并能增強其侵襲力和惡性程度。已有研究結(jié)果顯示，Smad2蛋白不同的腫瘤組織中的表達是不一致的：在結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、橫紋肌肉瘤等腫瘤組織中的smad2表達是上調(diào)的[6]，而在乳腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中，Smad2表達則是明顯下調(diào)的[7]。研究表明，宮頸癌的發(fā)生90%以上與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)，人乳頭瘤病毒中的癌基因E7 通過與Smad2、Smad3 、Smad4 相互作用阻斷了Smad 的轉(zhuǎn)錄活性，并抑制TGF-β活性，從而導(dǎo)致TGF-β通路紊亂而引起腫瘤發(fā)生[8]。Smads各組成分在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，還需要經(jīng)過深入研究，為腫瘤的防治另辟新徑。

我們成功構(gòu)建了Smad2 siRNA真核表達載體，該載體能特異地、有效地抑制宮頸癌HeLa細胞中Smad2蛋白表達水平,同時對Smad3表達無影響。該siRNA的表達載體，可用于探討Smad2在腫瘤細胞中的過低表達，是否影響其他重要蛋白的表達水平及其對細胞周期、細胞凋亡等功能的影響，為進一步研究Smad2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的功能打下了良好的基礎(chǔ)。

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