陳從波 姚啟盛 王曉康 楊 勇 劉正清

有研究表明，在膀胱癌的多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制中，多藥耐藥基因(multidrug resistance gene，MDR1)編碼的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的過(guò)度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的分子基礎(chǔ)。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是1種有效抑制基因表達(dá)的技術(shù)，能夠特異而有效地引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因的表達(dá)，具有穩(wěn)定、特異、低毒以及作用持久等特點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)以人膀胱癌細(xì)胞系/阿霉素(T24/ADM)細(xì)胞株MDR1基因?yàn)榘袠?biāo)的小干擾RNA，觀察其對(duì)MDR1基因表達(dá)及細(xì)胞株耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及器材

人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。阿霉素(adriamycin，ADM)(深圳益飛醫(yī)藥化工有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亞砜(DMSO,SIGMA公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD550，美國(guó)伯樂(lè)公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)，PCR儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GeneBank mdr1基因已知序列(基因編號(hào)NM000927)按siRNA序列設(shè)計(jì)的原則，從轉(zhuǎn)錄本mRNA的AUG起始密碼開(kāi)始，選取3條含21個(gè)堿基的序列，由上海生化工程公司合成其正義和反義單鏈，最后用SilenceTM siRNA Construction Kit(Ambion 公司)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄正義和反義單鏈成雙鏈siRNA，設(shè)隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照(si-neg)。SiRNA的序列如下：5′ GAGCUUAACACCCGACUUAUU3′,5′GAAAGUAUACCUCCAGUUUUU 3′,5′GAC CAUAAAUGUAAGGUUUUU3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

T24細(xì)胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用ADM濃度梯度遞增誘導(dǎo)法，直至細(xì)胞能在含1.0 mg/L 阿霉素的培養(yǎng)基中維持生長(zhǎng)，并能穩(wěn)定傳代30代以上，即成為耐藥人膀胱癌細(xì)胞模型T24/ADM，耐藥細(xì)胞在含0.1 mg/L ADM的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前無(wú)藥培養(yǎng)兩周。參照文獻(xiàn)[1]，用Oligofectamine 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)，按試劑盒操作說(shuō)明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,分別將3對(duì)siRNA以200 nmol/L的終濃度加入到T24/ADM細(xì)胞培養(yǎng)液中，孵育24～48 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR

應(yīng)用TRIZOL試劑(Gibico)提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)NCBI中cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為檢測(cè)的內(nèi)參照，PCR反應(yīng)引物由上海生物工程有限公司合成，其序列分別為，β-actin：F 5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’和R 5’-AGCCATGCCAAATGTCTCAT-3’,其cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為286 bp。MDR1:F 5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’和R5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’,其擴(kuò)增產(chǎn)物為167 bp。采用一步法進(jìn)行單管RT-PCR，反應(yīng)總體系為25 μl。反應(yīng)完成后取10 μl樣品在2%瓊脂糖凝膠中電泳，自動(dòng)電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)(Chiemlmage 5500)掃描凝膠并進(jìn)行定量分析。

1.5 Western方法檢測(cè)P-gp表達(dá)

將經(jīng)過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的各組T24/ADM細(xì)胞，用PBS洗滌2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入RIPA (美國(guó)Pierce)裂解液。冰上靜置10 min后，4℃ 、14 000 r/min，離心10 min后取上清。采用BCA法(美國(guó)Pierce)進(jìn)行蛋白定量后，蛋白樣品加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱10 min。蛋白樣品(每孔上樣量均為20 μg總蛋白)用SDS-PAGE凝膠(10% ，Invitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行電泳分離，分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVD膜，并與抗人P-gP及β-actin的第一抗體于4℃孵育過(guò)夜后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，DAB顯色。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組：①對(duì)照組，T24/ADM細(xì)胞；②陰性對(duì)照組，空轉(zhuǎn)染組；③T24細(xì)胞組；④轉(zhuǎn)染組。

1.6 MTT 法檢測(cè)ADM的半數(shù)抑制濃度(IC50)

將經(jīng)SiRNA轉(zhuǎn)染48 h后的各組T24/ADM細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，在96孔板的各孔中加入180 μl 細(xì)胞和不同濃度ADM，培養(yǎng)72 h后,加入MTT液20 μl/孔，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，充分震蕩10 min，應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)波長(zhǎng)570 nm處每孔的光密度值(A570值),按以下公式分別計(jì)算相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率。相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)，其中IC50A是T24/ADM細(xì)胞的IC50，IC50B是轉(zhuǎn)染siRNA的T24/ADM細(xì)胞的IC50，IC50C是T24細(xì)胞的IC50。

1.7 細(xì)胞內(nèi)阿霉素(ADM)積累量的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，按1×106/ml細(xì)胞濃度與1 μg/ml的ADM 37℃共同孵育1 h后，冰浴終止ADM的作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM穩(wěn)態(tài)積累量。以未經(jīng)過(guò)處理的T24/ADM細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T24/ADM 細(xì)胞MDR1 mRNA水平的變化

T24/ADM 細(xì)胞經(jīng)siRNA處理48 h后，3組MDR1mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照組MDR1/β-actin為0.56，另3組MDR1/β-actin分別為0.23、0.18和0.12。

圖1 T24/ADM細(xì)胞經(jīng)siRNA作用48 h后MDR1 mRNA表達(dá)水平

1為si-negative；2為si-mdr1-1；3為si-mdr1-2；4為si-mdr1-3；5為陰性對(duì)照

2.2 T24/ADM 細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)siRNA處理48 h后，P-gp蛋白表達(dá)均受到抑制，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，T24/ADM 細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)水平較親本細(xì)胞明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組細(xì)胞與陰性對(duì)照組細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)水平明顯下降,見(jiàn)圖2。

2.3 T24/ADM 細(xì)胞藥物敏感性的變化

3組siRNA 作用48 h后T24/ADM 細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性均增強(qiáng)(表1)，表明所設(shè)計(jì)的siRNA均可恢復(fù)T24/ADM 細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

圖2 各組細(xì)胞中P-gp表達(dá)的檢測(cè)

1為對(duì)照組細(xì)胞；2為陰性對(duì)照組細(xì)胞；3為T(mén)24/ADM細(xì)胞；4為si-mdr1-1細(xì)胞；5為 si-mdr1-2細(xì)胞；6為si-mdr1-3細(xì)胞

表1 siRNA作用后T24/ADM細(xì)胞的IC50

注：與T24/ADM細(xì)胞組比較，*為P<0.05

2.4 T24/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM積累量的變化

經(jīng)siRNA處理48 h的T24/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM穩(wěn)態(tài)累積量明顯增高(表2)，但與敏感株T24比較，熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率仍較低。

表2 siRNA處理后細(xì)胞內(nèi)ADM積累量情況

注：與未經(jīng)處理的T24/ADM細(xì)胞組比較，*為P<0.05

3 討論

目前，膀胱癌的化療效果不明顯，究其主要原因是腫瘤細(xì)胞中的多藥耐藥基因(MDR)的存在，導(dǎo)致很多化療藥物作用失敗。RNAi 作為1種新的研究工具，已經(jīng)在功能基因組學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。研究表明[2,3]體外合成的小分子dsRNA能直接觸發(fā)RNAi，這些小分子dsRNA被稱(chēng)為小干涉RNA(small interfering RNA)，即siRNA。Elbashir等[4]首次報(bào)道siRNA在哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)成功誘導(dǎo)基因特異阻抑以后，siRNA是否可應(yīng)用于人類(lèi)疾病的治療受到了廣泛的關(guān)注。在腫瘤基因治療中，通過(guò)人合成特定癌基因靶向的siRNA或構(gòu)建siRNA的表達(dá)載體，并導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，可以特異性地抑制目的基因的表達(dá)[5]RNAi技術(shù)的發(fā)展為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的基因治療提供了可能[6]。本研究以MDR1基因?yàn)槟繕?biāo)，針對(duì)MDR1基因設(shè)計(jì)了3條siRNA序列，以探討干擾RNA技術(shù)進(jìn)行多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的可行性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后MDR1 mRNA明顯下調(diào)，48 h后抑制率很高。并且P-gp蛋白的抑制率在48 h的時(shí)候也達(dá)到很高的水平。目前的研究發(fā)現(xiàn)，外源性的siRNA引發(fā)的RNAi僅為短時(shí)效應(yīng)，在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染人工合成的短片段RNA后，進(jìn)行基因和蛋白抑制檢測(cè)的高峰時(shí)間在轉(zhuǎn)染后的48～72 h，一般在轉(zhuǎn)染后3～5 d蛋白的抑制達(dá)到最高，5～7 d則恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。從我們的結(jié)果也可以看到，基因和蛋白的抑制基本遵循上述的規(guī)律。本研究中，ADM的IC50和ADM的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞內(nèi)積累量分析證實(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA后T24/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性及細(xì)胞內(nèi)ADM的積累量與對(duì)照組相比均有明顯差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定了siRNA干擾能夠有效抑制MDR1基因編碼蛋白P-gp的表達(dá)，說(shuō)明siRNA可能成為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的新方法。

總之，我們應(yīng)用了針對(duì)MDR1 RNA干擾技術(shù)，可以有效地抑制MDR1 mRNA表達(dá)，能夠有效抑制該基因編碼的P-gp蛋白表達(dá)，從而有效地逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性，如果能聯(lián)合應(yīng)用多種耐藥機(jī)制的siRNA，將能更有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，為治療腫瘤提供新的方法。

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[3]彭 智，肖志堅(jiān)，王 一，等.siRNA逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥研究〔J〕.中華血液學(xué)雜志，2004，25：5.

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