宋長(zhǎng)城 呂 祥 程彬彬 李 柏 凌昌全

肝細(xì)胞癌 (hepatocelluar carcinoma,HCC) 是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位居第二[1]。目前，根治性手術(shù)仍是 HCC 治療的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響手術(shù)療效的關(guān)鍵因素，且 HCC 的放射及化學(xué)治療效果均不理想。因此，探索新的治療手段很有必要。從臨床上行肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療 HCC 取得肯定療效來(lái)看，阻斷腫瘤血液供應(yīng)的治療方法有望成為 HCC 治療的突破口[2]。蜂毒素是從蜜蜂尾部螫針排出的毒汁中分離提純的1種動(dòng)物毒素。它具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種生物學(xué)活性。近年來(lái)，蜂毒素的抗腫瘤作用日益受到人們關(guān)注。體外研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒素可以通過(guò)不同機(jī)制對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的殺傷作用，是1種十分具有應(yīng)用前景的抗腫瘤天然藥物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，觀察蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響，探討其抗腫瘤血管生成的可能機(jī)制，以評(píng)價(jià)蜂毒素是否具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

4 ～ 6 周齡 BALB/C - nu/nu 雄性裸鼠，體重 18 ～ 20 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬) 2002-0002，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞株 BEL-7402 從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所引進(jìn)，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

蜂毒素為 Sigma 公司產(chǎn)品，批號(hào)：104K4016。鼠抗人 CD34單克隆抗體、鼠抗人 HIF-1α 單克隆抗體、鼠抗人 NF-κB 單克隆抗體和兔抗人 bFGF 多抗隆抗體均購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司。SABC 免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢 Boster 公司。

1.3 方法

1.3.1 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及腫瘤生長(zhǎng)觀測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 BEL-7402 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 2.5×107/ml，按 0.2 ml/只接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。待皮下腫瘤直徑達(dá) 0.5 ～ 0.7 cm 時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為生理鹽水 (normal sodium,NS) 組、沙利度胺 (thalidomide,TLD)(200 mg/kg/d) 組、蜂毒素低、中、高劑量組 (40 μg/kg/d、60 μg/kg/d、80 μg/kg/d)。分組后第 2 d 開(kāi)始給藥，每天 1 次，連續(xù) 10 d。每 2 d 測(cè)量腫瘤長(zhǎng)( a )、短徑( b )，并稱(chēng)裸鼠體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)復(fù)測(cè)瘤體大小并稱(chēng)重。按下列公式分別計(jì)算腫瘤體積 (V)、相對(duì)腫瘤體積 (RTV) 和相對(duì)腫瘤增殖率 (T/C)：TV = a×b2/2；RTV = V/V0(V0為給藥前測(cè)量所得體積，V 為處死前測(cè)量所得體積)；T/C = 治療組 RTV/陰性對(duì)照組 RTV×100%；腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(1-治療組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重) × 100%。

1.3.2 免疫組化染色 嚴(yán)格按照免疫組化 SABC 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。參照 Weidner[3]方法進(jìn)行 MVD 評(píng)估。光鏡下可見(jiàn) HIF-1α 和 bFGF 為胞質(zhì)著色，NF-κB 為胞質(zhì)或胞核著色，陽(yáng)性表現(xiàn)為棕色或棕褐色。應(yīng)用 IMS 細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色切片進(jìn)行分析，免疫組化陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)=陽(yáng)性面積/視野面積×光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況

以皮下瘤體直徑達(dá) 0.5 ～ 0.7 cm 為接種成功標(biāo)準(zhǔn)，裸鼠成瘤率為 100%。治療前各組裸鼠腫瘤大小無(wú)明顯差異 (P>0.05)，提示各組瘤體具有可比性。在治療過(guò)程中，NS 組腫瘤生長(zhǎng)較快，個(gè)別瘤體表面破潰，而蜂毒素各組及 TLD 組腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。治療結(jié)束后，蜂毒素低中高劑量組及 TLD 組相對(duì)腫瘤體積與 NS 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。蜂毒素各組的相對(duì)腫瘤增殖率與 TLD 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 蜂毒素對(duì)裸鼠及裸鼠移植瘤的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組裸鼠行動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食飲水正常，皮下未見(jiàn)出血點(diǎn)，無(wú)裸鼠自然死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后自眶靜脈采血行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，蜂毒素各組及 TLD 組外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板水平與 NS 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼處死裸鼠，各組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)胸腔及腹腔積液。取裸鼠心、肺、肝、腎及骨組織做石蠟切片，經(jīng) HE 染色未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。各組裸鼠用藥前、后體重見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)期間各組裸鼠體重均有增加，與 NS 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，提示蜂毒素在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)無(wú)明顯毒副作用。如表 2 所示，蜂毒素各組瘤重與 NS 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。與 TLD 組比較，蜂毒素中高劑量組瘤重明顯減輕 (P<0.05或P<0.01)，而低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蜂毒素低中高劑量組抑瘤率分別為 44.64%、62.86% 和 73.73%。

2.3 蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤 MVD 的影響

免疫組化染色顯示，蜂毒素各組及TLD組瘤體內(nèi)腫瘤微血管呈棕褐色條索狀，血管密度稀疏。與 NS 對(duì)照組比較，各藥物處理組 MVD 明顯下降 (P<0.01)。蜂毒素中、低劑量組 MVD 明顯高于 TLD 組 (P<0.01)，而高劑量組與 TLD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 蜂毒素對(duì)皮下移植瘤血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，NS 組中 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表達(dá)率高，著色較深，而蜂毒素各組及TLD組中上述血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)率低，著色淡。結(jié)果表明，蜂毒素低中高劑量組及 TLD 組 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表達(dá)水平明顯低于 NS 組 (P<0.01)。蜂毒素各組 bFGF 表達(dá)水平高于 TLD 組 (P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明 TLD 下調(diào) bFGF 的作用較蜂毒素強(qiáng)；蜂毒素中高劑量組 HIF-1α 表達(dá)水平與 TLD 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，而低劑量組卻明顯高于 TLD 組 (P<0.05)；TLD 組 NF-κB 表達(dá)水平明顯低于蜂毒素中低劑量組 (P<0.01)，而與蜂毒素高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)表 3。

表1 蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 (±s，n=6)

表1 蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 (±s，n=6)

組別裸鼠(只)腫瘤體積(mm3)治療前治療后相對(duì)腫瘤體積相對(duì)腫瘤增殖率(%)生理鹽水組676．72±8．61690．06±94．699．06±1．45100．00沙利度胺組671．93±15．53317．19±90．614．40±0．89?48．61蜂毒素低劑量組672．77±15．11324．86±88．514．42±0．58?48．78蜂毒素中劑量組678．29±22．65268．24±93．253．47±0．97?38．33蜂毒素高劑量組666．78±10．37202．35±78．083．06±1．23?33．82

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治療前后體重變化及瘤體重量 (±s，n=6)

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治療前后體重變化及瘤體重量 (±s，n=6)

組別裸鼠(只)裸鼠體重(g)治療前治療后瘤重(g)抑瘤率(%)生理鹽水組622．30±0．4022．17±0．660．79±0．210沙利度胺組622．25±1．3422．12±0．850．42±0．04?46．25蜂毒素低劑量組622．30±1．1823．2±0．640．44±0．04?44．64蜂毒素中劑量組623．27±0．7723．48±1．030．29±0．05?△62．86蜂毒素高劑量組622．37±1．4023．58±2．040．21±0．05?△△73．73

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01；與沙利度胺組比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

表3 蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表達(dá)的影響(±s,n=6)

表3 蜂毒素對(duì)裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表達(dá)的影響(±s,n=6)

組別微血管密度HIF-1α表達(dá)bFGF表達(dá)NF-κB表達(dá)生理鹽水組16．50±2．354．74±1．024．43±0．344．98±0．63沙利度胺組6．17±1．17?0．95±0．10?1．36±0．11?1．65±0．81?蜂毒素低劑量組11．33±1．86?△△1．53±0．15?△2．45±0．78?△△2．79±0．29?△△蜂毒素中劑量組9．17±1．17?△△1．45±0．19?△2．27±0．36?△△2．71±0．66?△△蜂毒素高劑量組6．67±1．21?1．14±0．05?△△2．10±0．27?△2．26±0．56?

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01；與沙利度胺組比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一大疾患，現(xiàn)有治療方法雖然較多，但尚無(wú)一種方法能夠單獨(dú)適用于所有患者。因此，研發(fā)高效、低毒、特異性強(qiáng)的抗 HCC 新藥已迫在眉睫。有研究發(fā)現(xiàn)，一些從天然藥物中提取的小分子物質(zhì)具有抗腫瘤血管生成作用，它們可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[4]。蜂毒素是 1 種最新提取、純化的小分子肽類(lèi)物質(zhì)，約占蜂毒干重的50%，由 26 個(gè)氨基酸組成[5]。近年來(lái)，我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)蜂毒素從提取純化到體內(nèi)外抗腫瘤效果作了深入的研究。結(jié)果表明，蜂毒素在體外對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、BEL-7402、Hep-3B 等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并可影響腫瘤細(xì)胞周期的正常移行，阻止 S 期細(xì)胞進(jìn)入 G2/M 期[6～8]。本實(shí)驗(yàn)是在既往研究的基礎(chǔ)之上，通過(guò)建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)蜂毒素體內(nèi)抗肝癌作用，以及對(duì) HCC 血管生成的影響。研究結(jié)果顯示，蜂毒素可以有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，治療組腫瘤重量及體積明顯減小，并且呈劑量依賴(lài)性，在本實(shí)驗(yàn)所取劑量范圍內(nèi)未見(jiàn)蜂毒素具有明顯不良反應(yīng)。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有血管依賴(lài)性。新生血管為腫瘤組織提供充足的養(yǎng)分，而且發(fā)育不完善的微血管也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了便利。腫瘤微血管是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)和必要條件，MVD 是評(píng)價(jià)腫瘤血管生成程度最客觀的指標(biāo)。有研究表明，MVD與腫瘤臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移，以及患者預(yù)后有密切關(guān)系[9]。MVD 越高，腫瘤侵襲性越強(qiáng)、轉(zhuǎn)移越早、預(yù)后越差。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，解剖裸鼠皮下移植瘤發(fā)現(xiàn)經(jīng)蜂毒素處理后的腫瘤組織顏色較蒼白，這可能與腫瘤微血管生成受到抑制有關(guān)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，蜂毒素能夠有效降低裸鼠皮下移植性肝癌組織 MVD，破壞腫瘤組織的新生血管。這提示，蜂毒素可以抑制HCC血管生成，降低腫瘤MVD，影響腫瘤組織血供，遏制腫瘤生長(zhǎng)。

HCC 是典型的富血管惡性腫瘤，豐富的血管是其快速生長(zhǎng)、早期轉(zhuǎn)移及廣泛浸潤(rùn)等生物學(xué)特性的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。HCC 的血管生成是 1 個(gè)由諸多調(diào)控因子參與的多步驟級(jí)鏈反應(yīng)過(guò)程，而促血管生成因子對(duì)新生血管起著正向調(diào)節(jié)作用。 bFGF 是腫瘤組織中作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一[11]，它與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合后促進(jìn)其增殖、分化、遷移。腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)較快的中心區(qū)域很容易發(fā)生缺氧，由此導(dǎo)致大量缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 廣泛表達(dá)，它可以結(jié)合于包括 bFGF 在內(nèi)的諸多靶基因的相應(yīng)位點(diǎn)，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，增加腫瘤血管通透性[12]。在諸多腫瘤血管生成調(diào)控因子之間，核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 起核心調(diào)控作用。有研究表明，NF-κB 在缺氧和酸性條件下被激活后可增強(qiáng)多種促血管生成因子的轉(zhuǎn)錄，兩者協(xié)同促進(jìn)腫瘤的血管生成[13]。當(dāng) NF-κB 表達(dá)受到抑制時(shí)，瘤體內(nèi)的促血管生成因子表達(dá)降低。本研究結(jié)果顯示，蜂毒素可有效下調(diào)促血管生成因子 HIF-1α 和 bFGF 的表達(dá)，隨著藥物劑量的增大抑制效果愈加明顯。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，蜂毒素在抑制 HIF-1α 和 bFGF 表達(dá)的同時(shí)亦下調(diào) NF-κB 表達(dá)，影響血管生成因子之間的協(xié)同關(guān)系，從而對(duì)裸鼠移植瘤的血管生成產(chǎn)生良好的阻斷效應(yīng)，進(jìn)而抑制肝癌的生長(zhǎng)。

綜上所述，蜂毒素具有抑制裸鼠皮下移植性肝癌生長(zhǎng)的作用，對(duì)腫瘤的血管生成產(chǎn)生較強(qiáng)的阻斷效應(yīng)，其作用機(jī)理可能與降低核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 的活性，進(jìn)而抑制 HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄，影響 bFGF 等促血管生成因子的表達(dá)有關(guān)，但對(duì)其具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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