田 雪，張寶持，白小佳，王艷萍

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

畢赤酵母表達(dá)風(fēng)味強(qiáng)化肽的分離與純化

田 雪，張寶持，白小佳，王艷萍

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

為了開發(fā)新型風(fēng)味強(qiáng)化劑，采用硫酸銨分段鹽析法、中空纖維超濾、陰離子交換樹脂分離等方法，對(duì)構(gòu)建的工程菌P.,postoris GS115-16B2發(fā)酵表達(dá)的16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽的分離純化效果進(jìn)行研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離純化最佳方法為：首先使用中空纖維進(jìn)行超濾濃縮，經(jīng)過兩次稀釋過濾濃縮后的濃縮液再采用離子交換樹脂 DEAE–52進(jìn)一步分離純化.經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，純化后16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽的平均純度可達(dá)93.19%.

畢赤酵母；風(fēng)味強(qiáng)化肽；鹽析；中空纖維超濾；離子交換樹脂；分離純化

風(fēng)味強(qiáng)化肽最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種八肽，它與食鹽、味精有較好的協(xié)同呈味作用，并且具有很好的熱穩(wěn)定性，適合于食品工業(yè)生產(chǎn)中的熱處理要求.因此，風(fēng)味強(qiáng)化肽有望代替味精成為新一代風(fēng)味強(qiáng)化劑，具有廣闊的市場(chǎng)前景.

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，數(shù)百種外源蛋白實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母、釀酒酵母等表達(dá)體系中的成功表達(dá)[1–2]，然而發(fā)酵液中目的蛋白難以分離純化已成為影響其應(yīng)用的主要問題.尤其是各種肽，由于其分子質(zhì)量小，表達(dá)出來(lái)的產(chǎn)物難于分離[3].

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出帶有16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽的高效表達(dá)載體，并將其整合到畢赤酵母(Pichia pastoris)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[4].本文在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)構(gòu)建的工程菌P. postoris GS115-16B2發(fā)酵表達(dá)的16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽的分離純化方法作了探索性嘗試，即分別運(yùn)用硫酸銨分段鹽析法、中空纖維超濾、陰離子交換樹脂分離方法和兩步分離法進(jìn)行分離純化，尋找出較好的分離純化工藝.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Pichia pastorisGS115-16B2，畢赤酵母基因組整合有16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽基因，由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 試劑與儀器

外源蛋白發(fā)酵樣品由本實(shí)驗(yàn)室制備；DEAE–52陰離子交換樹脂，南開大學(xué)化工廠；硫酸銨(分析純)，天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠.

中空纖維超濾膜(截留相對(duì)分子質(zhì)量為 6,000、60,000)，天津膜天膜公司；Power,PAC,3000電泳儀和全自動(dòng)凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司.

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液預(yù)處理

將收集到的發(fā)酵液在 6,000,r/min離心 20,min，除去大部分菌體，然后加熱到 100,℃煮沸 5,min，使大部分蛋白酶失活，迅速降溫，于－20,℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.2.2 硫酸銨分段鹽析

一級(jí)鹽析：取發(fā)酵上清液適量分裝，每瓶200,mL.將硫酸銨烘干研細(xì)，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30%、35%、40%、45%、50%和 55%向發(fā)酵上清液中緩慢加入硫酸銨，不斷攪拌至完全溶解，4,℃靜置 2,h，6,000,r/min、4,℃離心 20,min，沉淀溶于蒸餾水中，透析，SDS-PAGE檢測(cè)，找到目標(biāo)蛋白16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽沉淀較少而雜蛋白沉淀最多時(shí)的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù).

二級(jí)鹽析：取發(fā)酵上清液適量，按照一級(jí)鹽析的最適硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽析，然后將離心得到的上清液分裝，每瓶 200,mL.向上清液中緩慢加入硫酸銨粉末，不斷攪拌至完全溶解，使硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%和 90%.4,℃靜置 2,h，6,000 r/min、4,℃離心20 min，棄上清液，將沉淀溶于蒸餾水中，透析，并取相對(duì)應(yīng)的上清液進(jìn)行透析，SDS-PAGE檢測(cè).

1.2.3 發(fā)酵上清液的中空纖維超濾

將預(yù)處理過的發(fā)酵液通過截留相對(duì)分子質(zhì)量為60,000的中空纖維超濾膜，將小于60,000的超濾液再通過截留相對(duì)分子質(zhì)量為6,000超濾膜，收集相對(duì)分子質(zhì)量大于6,000的濃縮液，保存于－20,℃冰箱中.

1.2.4 陰離子交換層析分離

采用 DEAE–52層析柱(1.0,cm×40,cm)，流量為0.5,mL/min，用4～5個(gè)柱體積的緩沖液平衡層析柱，含 NaCl 濃度分別為 0、0.10、0.15、0.20、0.25,mol/L的Tris-HCl(pH,7.0)緩沖液進(jìn)行梯度洗脫.

回收率＝(洗脫液中蛋白質(zhì)量濃度×體積)/(原液蛋白質(zhì)量濃度×體積)×100%

1.2.5 蛋白質(zhì)量濃度與蛋白含量的測(cè)定方法

應(yīng)用 Bradford法[5]測(cè)定發(fā)酵液總蛋白質(zhì)量濃度.SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白含量[6].

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸銨分段鹽析

2.1.1 一級(jí)鹽析的確定

將預(yù)處理后的發(fā)酵液用 HCl或 NaOH調(diào)節(jié) pH至等電點(diǎn) 3.94.以硫酸銨作為鹽析劑，在不同鹽析質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽進(jìn)行分段鹽析沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示.

圖1 硫酸銨鹽析16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽沉淀SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide precipitation by ammonium sulfate salting

目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為 2.5×104，從圖 1可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 45%以下時(shí)，蛋白沉淀較少，當(dāng)達(dá)到50%時(shí)，開始出現(xiàn)較多的沉淀.因此，本研究選擇一級(jí)鹽析時(shí)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%.

2.1.2 二級(jí)鹽析

選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù) 45%進(jìn)行一級(jí)鹽析，通過SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示.

圖 2 硫酸銨二級(jí)鹽析 16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽沉淀 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide precipitation by ammonium sulfate salting

結(jié)合圖 1和圖 2可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%～60%時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度隨溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，沉淀蛋白電泳條帶越來(lái)越濃，當(dāng)在 70%～90%時(shí)，硫酸銨溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而沉淀蛋白電泳條帶相對(duì)變稀.為了得到更多的沉淀蛋白，本研究選擇二級(jí)鹽析時(shí)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%.

采用硫酸銨鹽析的方法在粗提階段提高所需蛋白純度，這在很多相關(guān)文獻(xiàn)中都有提及，如羅磊等[6]的“一步沉淀法”，Siegelman等[7]的“分步沉淀法”，胡一兵等[8]的“分段梯度鹽析法”，但這些方法或產(chǎn)物純度低，或重復(fù)性差，或鹽析次數(shù)多，或鹽析段過于狹窄等.本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行 0%～45%的硫酸銨鹽析，這段沉淀物可以拋棄(去除大多數(shù)雜質(zhì))；然后進(jìn)行 45%～60%的硫酸銨鹽析，可以得到較好的鹽析效果.但是從圖1和圖2可以看出，當(dāng)硫酸銨飽和度為 60%～90%時(shí)，上清液中仍然含有大量純度較高的目標(biāo)蛋白，回收率太低，因此放棄使用硫酸銨鹽析的方法進(jìn)行粗分，并且嘗試使用中空纖維方法分離、濃縮目標(biāo)風(fēng)味肽.

2.2 發(fā)酵上清液的中空纖維超濾

稀釋過濾即是在膜分離過程中向料液中加入滲透溶劑(一般是水)，使小分子和滲透溶劑一起去除，直到達(dá)到所需要的分離要求.顯然，如果產(chǎn)品是大分子，稀釋過濾類似于洗滌；而當(dāng)產(chǎn)品是小分子時(shí)，產(chǎn)品液體將被稀釋.因 16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽相對(duì)分子質(zhì)量小于 60,000，當(dāng)通過截留相對(duì)分子質(zhì)量 60,000的超濾膜時(shí)，是將溶液中的大分子雜質(zhì)去除.為了提高16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽的回收率，必須采用稀釋過濾.圖3為中空纖維超濾膜濃縮后發(fā)酵液的 SDS-PAGE凝膠電泳圖.

圖3 中空纖維分離液SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of hollow fiber separation

3、8和12泳道為濃縮后相對(duì)分子質(zhì)量在6 000～60,000樣品，其蛋白濃度明顯比 5號(hào)對(duì)照泳道深，說(shuō)明經(jīng)過中空纖維超濾膜濃縮后，16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽目的蛋白被高效濃縮；4、9和 13泳道蛋白條帶很淡甚至沒有條帶，說(shuō)明 6,000濾出液只含有少量的蛋白，達(dá)到很好的超濾濃縮效果.

2.3 離子交換樹脂DEAE-52純化16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽濃縮液

圖4 洗脫液鹽濃度對(duì)DEAE-52分離16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽影響Fig.4 Effect of eluent salt concentration on the separation of 16 copies flavor enhancing peptide by DEAE-52

通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選擇緩沖液pH為7.0，檢測(cè)洗脫液在220,nm下的吸收峰，得到洗脫曲線如圖4所示.圖 4結(jié)果顯示，Tris-HCl-NaCl梯度洗脫曲線在8、19、30、40和 49號(hào)管分別出現(xiàn)較高吸收峰，選擇這些吸收峰以及其附近的洗脫液，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示.

圖5 16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽洗脫峰SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of 16 copies flavor enhancing peptide elution peak

根據(jù)圖 5可知，目標(biāo)蛋白在第 40～49管洗脫液中析出，此時(shí) NaCl濃度為 0.25,mol/L，其中 46～49管洗脫液樣品純度較高.

2.4 兩步分離純化

首先使用中空纖維進(jìn)行超濾濃縮，濃縮分別經(jīng)過兩次超濾，得到相對(duì)分子質(zhì)量在 6,000～60,000的蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)結(jié)果顯示其蛋白質(zhì)量濃度為6.34,g/L，回收率達(dá)到 59%；采用 DEAE–52進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)，純化后 16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽平均純度可達(dá) 93.19%.將得到最佳的結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖6所示.

圖6 兩步分離純化結(jié)果的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of the separation and purification results

3 結(jié) 語(yǔ)

蛋白質(zhì)分離純化很難用單一方法實(shí)現(xiàn)，往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質(zhì)[9].理想的蛋白質(zhì)分離提純方法要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好，但實(shí)際上兩者難以兼顧，因此，考慮分離提純的條件和方法時(shí)，不得不在兩者之間作適當(dāng)?shù)倪x擇；一般情況下，科研上更多地選擇前者，工業(yè)生產(chǎn)上更多地選擇后者.因此，每當(dāng)需要提純某種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要明確分離純化的目的和蛋白質(zhì)的性質(zhì)，以便選擇最佳的分離純化方法，從而得到理想的效果[10].

本研究將預(yù)處理過的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化.分別采用了硫酸銨鹽析法、中空纖維超濾法和 DEAE–52進(jìn)行純化.經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定最佳方法為：首先使用中空纖維進(jìn)行超濾濃縮，濃縮分別經(jīng)過兩次超濾，通過截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為60,000和6,000的膜，得到相對(duì)分子質(zhì)量范圍在 6,000～60,000之間的蛋白質(zhì)，回收率達(dá)到 59%；采用 DEAE–52進(jìn)一步分離純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，純化后16拷貝風(fēng)味強(qiáng)化肽平均純度可達(dá)93.19%.

［1］Shi X，Karkut T，Chamankhah M，et a1. Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody(scFv)gene in Pichia pastoris[J]. Protein Expr Purif，2003，28(2)：321–330.

［2］官孝群，王躍祥，吳良成，等. 血管生成抑制因子 K4K5 cDNA基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(2)：126–130.

［3］朱家文，武斌，陳葵，等. 離子交換層析分離純化重組人血清白蛋白[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，28(4)：341–345.

［4］王艷萍，高文，侯建華，等. 牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽(BMP)表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報(bào). 2008，23(3)：16–20.

［5］Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1979，72：248–254.

［6］Guo Y J. Protein electrophoretic technique[M]. Beijing：Science Press，1998：54–58.

［7］羅磊，丁霄霖. 聚丙烯酰胺凝膠電泳研究硫酸銨鹽析分離豬血清 IgG[J]. 食品研究與開發(fā)，2006，27(1)：82–88.

［8］Siegelman H W，Kycia J H. Algal biliproteins：Handbook of phycological method[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1978：71–79.

［9］胡一兵，胡鴻鈞，李夜光，等. 從一種富含藻膽蛋白的螺旋藻中大量提取和純化藻藍(lán)蛋白的研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2002，20(4)：299–302.

［10］Wang H X，Ng T B. Purification of castamollin，a novel antifungal protein from Chinese chestnunts [J]. Protein Expression and Purification，2003，32(1)：44–51.

［11］Wang H X，Ng T B. Alocasin，an anti-fungal protein from rhizomes of the giant taro Alocasia macrorrhiza[J]. Protein Expression and Purification，2003，28(1)：9–14.

Separation and Purification of Flavor Enhancing Peptide fromPichia Pastoris

TIAN Xue，ZHANG Bao-chi，BAI Xiao-jia，WANG Yan-ping
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The separation and purification method of 16 copies flavor enhancing peptide fromPichia Pastorisfermentation broth was studied by fractional salting out，hollow fiber ultra filtration and anion exchange resin. The results showed the best separation and purification method. The broth was first ultra filtration enriched twice by hollow fiber column，and then further purified by ion-exchange resin DEAE-52. After the purification，the average purity of 16 copies flavor enhancing peptide was 93.19% detected by SDS-PAGE.

Pichia pastoris；flavor enhancing peptide；salting-out；hollow fiber ultra filtration；ion exchange resin；separation and purification

Q503

A

1672-6510(2011)04-0014-04

2011–02–18；

2011–03–15

天津市東麗區(qū)科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(20101306)；天津市科技發(fā)展計(jì)劃(05YFGHHZ00200)

田 雪（1985—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：王艷萍，教授，博士生導(dǎo)師，ypwang@tust.edu.cn.