魏 偉，劉 倩，盧利寧，謝希賢

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

大腸桿菌L-組氨酸生物合成途徑的改造及其對工程菌L-組氨酸產(chǎn)量的影響

魏 偉，劉 倩，盧利寧，謝希賢

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

改造大腸桿菌L–組氨酸生物合成途徑，以提高L–組氨酸的產(chǎn)量.用NTG誘變大腸桿菌M-17(SGr)，依次賦予其 2–噻唑丙氨酸(2-TA)和組氨酸氧肟酸鹽(HisHx)遺傳標(biāo)記，再以突變株 M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)基因組為模板，擴(kuò)增組氨酸操縱子基因，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pUC118-his-operon，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入突變株M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)得到工程菌E. coli M-19(SGr＋2-TAr＋HisHxr/pUC118-his-operon).根據(jù)zwf和prs基因序列分別合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pSTV28連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至工程菌E. coli M-19，搖瓶發(fā)酵測定重組工程菌L–組氨酸的產(chǎn)量.搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，L–組氨酸產(chǎn)量與對照株相比，工程菌E. coli M-19提高了4.5倍，雙質(zhì)粒系統(tǒng)重組工程菌E. coli MZH-19、E. coli MPH-19和E. coli MZPH-19分別提高了5.14、5.78、8.43倍.

L–組氨酸；組氨酸操縱子；大腸桿菌；雙質(zhì)粒系統(tǒng)；搖瓶發(fā)酵

L–組氨酸的化學(xué)名為 L–α–氨基–β–咪唑丙酸，是含有咪唑核的堿性氨基酸，具有多種生理功能，在醫(yī)藥、飼料及食品行業(yè)發(fā)揮著重要的作用[1].目前，國內(nèi)對發(fā)酵生產(chǎn)組氨酸的研究和報道較少，且產(chǎn)酸水平較低.其中姚曉玲等[2]利用黃色短桿菌發(fā)酵可積累 L–組氨酸 128.28,mg/L，許益清等[3]以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，定向選育突變株，發(fā)酵 3,d產(chǎn) L–組氨酸達(dá)1～1.6,g/L.但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，因此加快研究發(fā)酵生產(chǎn)L–組氨酸的意義重大.

本文通過亞硝基胍(NTG)誘變選育具有組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的突變株，解除 L–組氨酸對生物合成途徑上的關(guān)鍵酶[4]——ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(ATP-PRT，hisG 基因編碼)的反饋抑制.利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)對 L–組氨酸生物合成途徑進(jìn)行改造，過表達(dá)整個組氨酸操縱子和中心代謝途徑的zwf和prs基因，增加大腸桿菌 L–組氨酸生物合成的代謝流，以期進(jìn)一步提高 L–組氨酸產(chǎn)量，并為構(gòu)建高產(chǎn) L–組氨酸工程菌奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

E. coli DH5α及 E. coli M-17(SGr)均為天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；質(zhì)粒 pUC118、pSTV28，TaKaRa公司.

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl,10，pH,7.0，抗生素氨芐青霉素使用質(zhì)量濃度為 100μg/mL，氯霉素使用質(zhì)量濃度為25,μg/mL.

基本培養(yǎng)基：葡萄糖 5，硫酸銨 10，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂 0.4，硫酸錳 0.01，硫酸亞鐵 0.01，VB1,100,μg，VH,100,μg，瓊脂粉 20，pH,7.0～7.2.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 15，硫酸銨 3，玉米漿10,mL，磷酸二氫鉀 1.0，硫酸鎂 0.4，硫酸錳 0.01，硫酸亞鐵 0.01，VB1300,μg，VH200,μg，pH,7.0～7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20，硫酸銨 10，玉米漿20,mL，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.015，硫酸亞鐵 0.015，VB1,200,μg，VH,100,μg，pH,7.0～7.2.

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶，TaKaRa 公司；Long PCR Enzyme Mix、1 000 bp ladder，F(xiàn)ermentas公司；PCR引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司；質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒，北京博邁德公司；IPTG、X-gal、氨芐青霉素、氯霉素，北京索萊寶公司；誘變劑亞硝基胍(NTG)，日本 TCI公司；L–組氨酸(L-His)、2–噻唑丙氨酸(2-TA)及組氨酸氧肟酸鹽(HisHx)，美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3 方法

1.3.1 誘變方法

常規(guī)化學(xué)誘變法，參見文獻(xiàn)[5].

1.3.2 目的突變株的篩選

結(jié)構(gòu)類似物突變株的獲得：將誘變處理的菌液適度稀釋后涂布于含有一定濃度的 2-TA和 HisHx的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2～3,d，挑出單菌落，即得到結(jié)構(gòu)類似物2-TA和HisHx抗性突變株.

1.3.3 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) GenBank中 E. coli K-12編碼 his operon(7,461,bp)、zwf(1,476 bp)和 prs(948,bp)基因序列，分別設(shè)計(jì)引物，在兩端引入酶切位點(diǎn)(下劃線所示)和保護(hù)堿基.分別用引物 H1(CTCGTCGGATCC TCCTTTCCCCGCTCATTCATT)/H2(TGTTCGGGA TCC AAGAAAAAGGGCAGGGTGGTG)、Z1(GCAA GGATCC ACTTAAGGAGAATGACATGGCGGT)/Z2(TGAGCGCATGCCGCAGATATTACTCAAACTCA T)和P1(GCTAGAATTC CCTGAGGTTCTTCTCGT GCCTGATA)/P2(AGCCGGATCCTTAGTGTTCGAA CATGGCAGAGATC)來擴(kuò)增突變株 E.,coliM-18(SGr+2-TAr+HisHxr)的 his operon、zwf和prs基因及其上下游部分序列，其中長片段his operon基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 50,μL，反應(yīng)條件為：94,℃,2,min，94,℃,20,s，55,℃,30,s，68,℃,6,min，共 25 個循環(huán)；68,℃,10,min.DNA片段的回收、酶切、純化、與載體的連接、轉(zhuǎn)化等操作參見文獻(xiàn)[6].

1.3.4 his operon、zwf和prs基因的克隆與測序

取PCR產(chǎn)物5,μL在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，使用 DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物直接與 pMD19-T Simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.,coliDH5α,感受態(tài)，在含 IPTG(24,mg/mL)和 X-gal(20,mg/mL)的 Ampr(100,μg/mL)的 LB 平板上 37,℃培養(yǎng)16,h，隨機(jī)挑選白色菌落進(jìn)行PCR；并提取質(zhì)粒單酶切驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒 pMD19-his-operon、pMD19-zwf和pMD19-prs，進(jìn)行測序和序列分析.

1.3.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切重組質(zhì)粒 pMD19-his-operon，純化回收后，與 pUC118BamHI/BAP載體按等物質(zhì)的量比連接轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化E.,coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定.用限制性內(nèi)切酶BamHI和SphI對重組質(zhì)粒 pMD19-zwf及質(zhì)粒pSTV28雙酶切，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對重組質(zhì)粒 pMD19-prs及質(zhì)粒 pSTV28雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，按照質(zhì)粒 DNA與目的基因物質(zhì)的量比為 1∶4進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.,coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氯霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證.

1.3.6 搖瓶發(fā)酵

種子培養(yǎng)：500,mL擋板瓶中裝液量為30,mL，9層紗布封口，往復(fù)式搖床200,r/min、32,℃培養(yǎng)12～15,h.

搖瓶發(fā)酵：按10%的接種量將種子液接入裝液量為27,mL的500,mL擋板瓶中，搖床200,r/min、32,℃培養(yǎng) 36,h.發(fā)酵期間補(bǔ)加氨水控制 pH在 7.0左右，流加60%葡萄糖，使其維持在1%～2%.

1.3.7 分析方法

采用高效液相分析系統(tǒng)測定L–組氨酸含量[7].

2 結(jié)果與分析

2.1 組氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株的篩選

利用NTG對出發(fā)菌株E. coli M-17(SGr)進(jìn)行誘變處理，將其涂布到含有 2-TA(3,g/L)的基本培養(yǎng)基上，篩選到11株能積累 L–組氨酸的突變株，在這 11株菌中選活力較高的突變株 E.,coli M-17(SGr＋2-TAr)為再次誘變的出發(fā)菌株.在野生菌體內(nèi)，當(dāng)L–組氨酸含量達(dá)到生理需要時，L–組氨酸操縱子受到終產(chǎn)物L(fēng)–組氨酸的反饋?zhàn)瓒?另外，合成途徑的第1個酶ATP-PRT是L–組氨酸合成途徑的限速酶，酶活性受到終產(chǎn)物 L–組氨酸的反饋抑制[4].通過賦予組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性標(biāo)記可以解除 L–組氨酸對 ATPPRT的反饋抑制[8].對突變株E. coli MTA-17(SGr+2-TAr)再次誘變，同樣方法篩選得到 HisHx(10 g/L)的抗性突變株E. coli M-18(SGr+2-TAr+ HisHxr)，但是該突變株的組氨酸產(chǎn)量沒有明顯的提高.

2.2 his operon、zwf和prs基因的PCR擴(kuò)增

以提取的突變株 M-18的基因組為模板，H1/H2、Z1/Z2和 P1/P2為引物分別擴(kuò)增部分脫敏的his operon、zwf和prs基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖 1所示.在約 7,500、1,500、1,000,bp處有目的條帶，與預(yù)期大小相符.

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其酶切驗(yàn)證

按方法 1.3.5構(gòu)建重組質(zhì)粒，并對陽性克隆進(jìn)行限制性酶切分析，結(jié)果如圖 2所示.重組質(zhì)粒pUC118-his-operon、pSTV28-zwf、pSTV28-prs 和pSTV28-zwf-prs雙酶切后與預(yù)期大小相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖2 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of recombinant plasmids by digestion

將重組質(zhì)粒 pUC118-his-operon、pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs分別轉(zhuǎn)化至突變株E.coli M-18，得到重組工程菌 M-19(SGr+,2-TAr+His Hxr/pUC118-his-operon)、MZH-19(SGr+,2-TAr+HisHxr/pSTV28-zwf/pUC118-his-operon)、MPH-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pSTV28-prs/pUC118-his-operon和MZPH-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pSTV28-zwf-prs/pUC118-hisoperon).

2.4 工程菌的搖瓶發(fā)酵

將重組工程菌 E.,coli M-19、E. coli MZH-19、E.coli MPH-19、E.,coli MZPH-19和對照株E.,coli M-18進(jìn)行搖瓶發(fā)酵36,h，測定L-組氨酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同菌株的L-組氨酸搖瓶發(fā)酵36 h產(chǎn)量的比較Fig.3 Production of 36 h flask-shaking fermentation of L-histidine

由圖3可知，工程菌E. coli M-19、E. coli MZH-19、E. coli MPH-19、E. coli MZPH-19 的 L–組氨酸產(chǎn)量與對照株相比，分別提高了 4.5、5.14、5.78、8.43倍.工程菌 E. coli M-19中重組質(zhì)粒攜帶了脫敏的his operon基因，L–組氨酸產(chǎn)量提高，推測其原因?yàn)樘岣吡似湓诖竽c桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)及其所編碼酶的活性.zwf基因編碼的 G-6-PDH是 HMP途徑的限速酶，工程菌E. coli MZH-19在過表達(dá)his operon的同時又過表達(dá)了 zwf基因，使得 L–組氨酸產(chǎn)量提高，推測其原因?yàn)楣こ叹鶨. coli MZH-19的HMP途徑相對活躍，且 G-6-PDH催化產(chǎn)生了大量的 NADPH和H+，為生物體的合成提供還原力，同時也為L–組氨酸的合成提供了氫供體.工程菌E. coli MPH-19共表達(dá)了his operon和prs基因，使得L–組氨酸產(chǎn)量提高，推測其原因?yàn)?prs基因的過表達(dá)為 L–組氨酸的合成提供了更多的前體物質(zhì)PRPP.工程菌E. coli MZPH-19表達(dá)了his operon和zwf-prs，使得L–組氨酸產(chǎn)量提高，推測其原因?yàn)?L–組氨酸合成的中心代謝途徑——HMP途徑增強(qiáng)，前體物質(zhì)PRPP增多，葡萄糖的整個代謝流向合成L–組氨酸的方向分布.

3 結(jié) 語

L–組氨酸的合成代謝途徑較長，調(diào)控相對復(fù)雜，因此通過誘變單一地選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株并不會完全打通菌體內(nèi)合成 L–組氨酸的代謝途徑，進(jìn)而大量積累組氨酸.本研究通過傳統(tǒng)的誘變方法和基因工程相結(jié)合的手段來構(gòu)建 L–組氨酸基因工程菌，對大腸桿菌 L–組氨酸生物合成的代謝途徑進(jìn)行了改造.首先用亞硝基胍(NTG)誘變 E.,coli M-17(SGr)，依次賦予其2-TA和HisHx遺傳標(biāo)記，得到突變株 E.,coli M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)，再以提取的突變株E.,coli M-18基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增突變株的整個組氨酸操縱子基因，并將其連接到pUC118載體上，過表達(dá)組氨酸生物合成途徑上的一系列酶系，從而使組氨酸得到積累.由于重組質(zhì)粒pUC118-his-operon在 11,000,bp左右，不易再進(jìn)行分子生物學(xué)操作，故選擇了另一個可以相容的質(zhì)粒pSTV28進(jìn)行進(jìn)一步的改造，且 pSTV28質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，更有利于代謝物的生成.本研究利用了復(fù)制子不同的兩個相容性質(zhì)粒 pSTV28(復(fù)制子為 p15A)和 pUC118(復(fù)制子為 pMB1)對 L–組氨酸生物合成途徑進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，擴(kuò)增了 L–組氨酸生物合成中心代謝途徑的關(guān)鍵酶編碼基因 zwf和編碼合成L–組氨酸的前體物質(zhì)PRPP的prs基因.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙質(zhì)粒重組基因工程菌E. coli MZH-19、E.,coli MPH-19和 E.,coli MZPH-19與對照株比較，L–組氨酸產(chǎn)量分別提高了5.14、5.78、8.43倍，因此雙質(zhì)粒系統(tǒng)的改造可進(jìn)一步提高L–組氨酸的產(chǎn)量.

［1］陳寧. 氨基酸工藝學(xué)[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

［2］姚曉玲，曾瑩，宋衛(wèi)江. L–組氨酸產(chǎn)生菌的誘變選育[J]. 中國釀造，2007(7)：18-20.

［3］許益清，張偉國. L–組氨酸產(chǎn)生菌株的選育[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(1)：83-85.

［4］Mizukami T，Hamu A，Ikeda M，et al. Cloning of the ATP phosphoribosyl transferase gene ofCorynebactewium glutamicumand application of the gene to L-histidine production[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，1994，58(4)：635-638.

［5］施巧琴，吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué)[M]. 2版. 北京：科學(xué)出版社，2003.

［6］Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F， Maniatis T，等. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 2版. 北京：科學(xué)出版社，2002.

［7］張昌偉，徐慶陽，劉淑云，等. 2，4-二硝基氟苯衍生法測定發(fā)酵液中組氨酸方法的優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代化工，2007，27(S2)：743-943.

［8］Araki K，Nakayama K. L-histidine production by histidine analog-resistant mutants from several bacteria[J].Agricultural Biology and Chemistry，1971，35(13)：2081-2088.

Modification of L-histidine Biosynthesis Pathway inE. coliand Its Effect on L-histidine Yield

WEI Wei，LIU Qian，LU Li-ning，XIE Xi-xian
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To modify the metabolic pathway of L-histidine biosynthesis inE. coliand increase L-histidine yield. E. coli M-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)was obtained by N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)mutagenesis derived from the original strainE. coliM-17(SGr). The histidine operon was amplified by PCR fromE. coliM-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)chromosome and ligated it into the pUC118 vector. The recombinant plasmid pUC118-his-operon was transformed intoE. coliM-18(SGr＋2-TAr＋HisHxr)by electroporation. Thezwfgene and prs gene were amplified by PCR，and then ligated to pSTV28 plasmid. The recombinant plasmids pSTV28-zwf，pSTV28-prs and pSTV28-zwf-prswere transformed intoE. coliM-19(SGr＋2-TAr＋HisHxr/pUC118-his-operon)，respectively. Flask-shaking fermentation results showed that，compared withE. coliM-18，the L-histidine yield in the engineering strainE. coliM-19 was 4.5 folds of that in the control，and in the two-plasmid system of recombinant engineering strainsE. coliMZH-19，E. coliMPH-19 andE. coliMZPH-19 were 5.14 folds，5.78 folds and 8.43 folds of that in the control，respectively.

L-histidine；his operon；Escherichia coli；two-plasmid system；flask-shaking fermentation

Q812

A

1672-6510(2011)04-0006-04

2010–12–09；

2011–03–01

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI63B01)

魏 偉（1985—），男，山西長治人，碩士研究生；通信作者：謝希賢，副教授，xixianxie@tust.edu.cn.