郭新艷,王紅亮,金燕鋒,劉英華,唐剛?cè)A,姜申德,＊

1.天津大學藥物科學與技術學院,天津 300072;

2.中山大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科 PET-CT中心,廣東廣州 510080

細胞凋亡顯像劑[18F]FEDPA的合成和標記

郭新艷1,王紅亮1,金燕鋒1,劉英華1,唐剛?cè)A2,＊,姜申德1,＊

1.天津大學藥物科學與技術學院,天津 300072;

2.中山大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科 PET-CT中心,廣東廣州 510080

為制備新型細胞凋亡顯像劑[18F]FEDPA,合成了前體(2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-胺,總收率5%(以化合物4計)。后經(jīng)過18F標記合成[18F]FEDPA,標記率(8.9±0.3)%(經(jīng)校正,n=2),HPLC檢測其放射化學純度為77%。

18F-標記;細胞凋亡;[18F]FEDPA;合成

正電子發(fā)射斷層成像(PET)是研究正電子類放射性顯像劑(18F,11C,15O和13N等核素標記的顯像劑)在生物體內(nèi)代謝分布的一種功能性顯像技術,近年來在醫(yī)學研究、臨床診斷及新藥研發(fā)等方面都有廣泛應用[1]。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象,在保證多細胞生物的細胞分化、器官發(fā)育中起著重要的作用。細胞凋亡與許多疾病諸如腫瘤、阿爾茨海默病、帕金森病等有著重要的聯(lián)系[2]。磷脂酰絲氨酸(PS)存在于正常細胞的細胞膜內(nèi)部,細胞發(fā)生凋亡的早期,PS就會外翻到細胞膜的外層,蛋白質(zhì)Annexin V可以特異性地與 PS結(jié)合[3-4]。目前細胞凋亡的檢測主要是將顯像基團引入到 Annexin V中,如Annexin V-FITC,通過熒光基團檢測細胞凋亡情況[5];而99Tcm-Annexin V是一類研究較為透徹、應用較廣的放射性活體細胞凋亡顯像劑,已進入臨床試驗階段,應用于疾病細胞凋亡檢測以及惡性腫瘤放化療的療效評價等[6]。但是,Annexin V有一定的缺點:Annexin V是一種蛋白質(zhì),相對分子質(zhì)量較大(3.6×104),易降解,體內(nèi)結(jié)合速率和血液清除較慢[7]。

近期,Smith小組設計出可以與PS特異性結(jié)合的具有二吡啶甲基胺(DPA)基團的熒光大分子化合物,PSS-480(圖1)。鋅絡合的二吡啶甲基胺與PS產(chǎn)生特異性結(jié)合后,通過熒光顯微鏡可進行體外細胞凋亡檢測[8]。

圖1 PSS-480結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of PSS-480

為了研究用于體內(nèi)細胞凋亡檢測的PET顯像劑,本工作采用鋅絡合的二吡啶甲基胺類化合物為框架結(jié)構(gòu),設計核素18F標記的新型細胞凋亡顯像劑[18F]FEDPA,并報道[18F]FEDPA的放射合成及其前體的有機合成。

1 儀器與試劑

Reichert-Thermovar熔點儀,奧地利 Reichert公司;N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器公司;Bruker AvanceⅢ400 MHz核磁儀,德國Bruker公司;Merck 60F254硅膠板,德國 Merck公司;Kugelrohr GKR-50高溫蒸餾儀,瑞士Buchi公司;硅膠,粒徑0.037～0.056 mm,煙臺化學工業(yè)研究所;Cyclone 10/5型回旋加速器,比利時IBA公司;PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊,北京派特生物有限公司;CRC-15R放射性活度計,美國CAPINTEC公司;1200 Series高效液相分析色譜儀(HPLC),美國Agilent公司;流動相放射性檢測器,B-FC-3200高能 PMT檢測器,美國華盛頓BIOSCAN公司。所用試劑均為分析純或化學純。

2 實驗方法

2.1 [18F]FEDPA前體的合成路線

[18F]FEDPA的逆合成路線示于圖2。其中前體1經(jīng)多步有機反應合成,其合成路線示于圖3—5。

2.2 實驗步驟

2.2.1 二甲基吡啶胺(化合物3)的合成[9]2-氰基吡啶(15 g,144 mmol),1.2 g Pd/C(Pd的質(zhì)量分數(shù)為5%),加入乙醇水溶液(V(乙醇)∶V(水)=6∶1)。用氫氣置換高壓釜內(nèi)空氣6次,然后加壓至2×106Pa,控溫25℃,攪拌反應5 h,反應完畢。過濾除去Pd/C,減壓蒸去溶劑,得到黃色油狀液體15.17 g。Kugelrohr高溫蒸餾儀純化,真空度150 mm汞柱,除去170℃餾分,收集270℃餾分,得到8.83 g化合物3,為金黃色透明液體,收率30%。

2.2.2 (2-[2-(2-疊氮基)乙氧基]乙氧基)-乙醇(化合物 5)的合成[10]三縮乙二醇(10.5 g,70 mmol)溶于150 mL干燥的四氫呋喃,加入三乙胺(15 mL,50 mmol),將體系冷卻至0℃,滴入甲磺酰氯(3.87 mL,25 mmol),室溫攪拌1 h。將反應液蒸干,加入蒸餾水30 mL,乙酸乙酯萃取(30 mL×3),無水硫酸鈉干燥、濃縮,得到淺黃色油狀液體4.25 g。加入30 mL乙醇中,將疊氮化鈉(3.25 g,50 mmol)溶于10 mL蒸餾水,滴加到反應溶液中,體系加熱到50℃,反應7 h。加入100 mL蒸餾水,80 mL乙酸乙酯,攪拌分液。乙酸乙酯萃取(100 mL×4),合并有機層,無水硫酸鈉干燥、濃縮,硅膠柱層析分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶9),得到1.69 g化合物5,收率38%。

圖2 目標化合物的逆合成分析Fig.2 Retrosynthetic analysis of target compounds

圖3 化合物3的合成Fig.3 Synthesis of compound 3

圖4 化合物7的合成Fig.4 Synthesis of compound 7

2.2.3 2-[2-(2-叔丁氧酰胺基)乙氧基]乙氧基-乙醇(化合物 6)的合成 化合物 5(1.69 g,9.65 mmol)溶于50 mL四氫呋喃中,加入三苯基磷(2.53 g,9.65 mmol),液封,室溫反應30 min,加入10 mL蒸餾水,室溫攪拌反應15 h。加鹽酸水溶液調(diào)p H=3,加入30 mL乙酸乙酯,分離水層,有機層用蒸餾水(30 mL×3)萃取,將水層合并,氫氧化鈉調(diào)p H=13。加入(Boc)2O(3.16 g,14.47 mmol),室溫反應30 min,乙酸乙酯萃取(70 mL×3),收集有機相,用無水硫酸鈉干燥,旋干得到3.80 g化合物6粗品。

2.2.4 2-(2-(2-(叔丁氧羰基)乙氧基)乙氧基)對甲磺酸乙酯(化合物7)的合成 化合物6粗品(3.37 g,13.5 mmol)溶于20 mL干燥的二氯甲烷中,冰浴冷卻后加入三乙胺(2.34mL,16.2 mmol),接著滴入對甲苯磺酰氯(3.08 g,16.2 mmol),滴加完畢后,室溫反應過夜。將反應液旋干,加入蒸餾水,乙酸乙酯(20 mL×3)萃取,合并有機相。無水硫酸鈉干燥,旋干溶劑,得黃色透明油狀物,硅膠柱層析分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶2)得到化合物7純品3.50 g,收率83%。

圖5 前體1的合成Fig.5 Synthesis of compound 1

2.2.5 (2-{2-[2-(3,5-二羥甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物9)的合成 將化合物7(2.3 g,7.34 mmol)、3,5-二羥甲基苯酚(1.13 g,7.34 mmol)、無水碳酸鉀(3.04 g,22.02 mmol)、20 mL乙腈加入到燒瓶中,加熱回流反應11 h。將反應體系中的乙腈蒸干,加入20 mL蒸餾水,氫氧化鈉調(diào)p H=13,乙酸乙酯萃取(20 mL×3)。合并有機層,無水硫酸鈉干燥、濃縮,硅膠柱層析分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶8),得到化合物9黃色油狀液體1.32 g,收率47%。

2.2.6 (2-{2-[2-(3,5-二甲磺酰氧基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物10)的合成 化合物9(1.32 g,3.42 mmol)溶于10 mL干燥的二氯甲烷中,冰浴冷卻至0℃,加入三乙胺(2.08 g,20.54 mmol),滴入甲磺酰氯(2.35 g,20.54 mmol),室溫反應1 h。減壓蒸出溶劑,加入20 mL蒸餾水,二氯甲烷萃取(20 mL×3),合并有機相,無水硫酸鈉干燥后,濃縮,柱層析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶2),得到化合物10無色液體1.23 g,收率66%。

2.2.7 (2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(化合物11)的合成[11]將化合物10(1.15 g,2.12 mmol)溶于25 mL乙腈中,加入無水碳酸鉀(1.17 g,8.46 mmol)、二甲基吡啶胺(1.06 g,5.3 mmol),氬氣保護,室溫反應過夜。先將乙腈蒸出,加入蒸餾水15 mL,乙酸乙酯萃取(20 mL×3),合并有機相。無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑,得到化合物11棕黃色油狀液體1.71 g。

2.2.8 (2-{2-[2-(3,5-二-N,N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-胺(前體1)的合成 將化合物11粗品1.71 g,加入10 mL二氯甲烷充分溶解,冰浴冷卻,滴加三氟乙酸的二氯甲烷溶液(φ=50%)10 mL,室溫反應4 h。減壓蒸出溶劑,加入飽和碳酸鈉溶液調(diào)p H=10,二氯甲烷萃取(20 mL×4),合并有機相。干燥、濃縮,得到棕紅色油狀液體,硅膠柱層析分離(V(乙酸乙酯)∶V(氨的甲醇溶液)=5∶1,氨的甲醇溶液濃度為4.11 mol/L),得到純品0.69 g,兩步反應收率50%。

2.3 [18F]FEDPA的制備

在合成[18F]FEOTs時,采用文獻[12]中的方法,二對甲苯磺酸乙二醇酯和[18F]KF在100℃下反應6 min。經(jīng) Sep Pak SiO2小柱分離純化后,得到放化純度大于95%的[18F]FEOTs,然后與前體1反應。[18F]FEDPA的合成路線示于圖6。

圖6 [18F]FEDPA的合成Fig.6 Synthesis of[18F]FEDPA

用氟多功能合成模塊(圖7)進行18F標記,具體標記操作如下:

(1)18F-由 Cyclone 10/5通過18O(p,n)18F反應生產(chǎn);

(2)18F-被 QMA捕獲后,用瓶 a中的1.5 mL K2CO3和 K222混合液(30 mg/1 mL水溶液-130 mg/10 mL K222乙腈溶液)將其洗脫,進入反應管Ⅰ中;

(3)在116℃加熱反應管6 min,蒸發(fā)溶劑;冷卻后加入瓶b中的乙腈,116℃蒸干溶劑,干燥反應管至無液體殘留,然后冷卻;

(4)瓶c中加入二對甲苯磺酸乙二醇酯(8 mg)的乙腈(1 mL)溶液,100℃下密閉反應6 min,濃縮反應溶液后,冷卻反應管;

(5)瓶d中的乙醚(5 mL)加入到反應管Ⅰ;

(6)將反應液通過V7與V10之間相連的Sep Pak SiO2小柱,液體進入反應管Ⅱ中(裝有碳酸鉀8 mg),并在90℃下將乙醚蒸除;

(7)重復(5)和(6)中的操作;

(8)瓶g中加入前體化合物1(5 mg)的DMF溶液至反應管Ⅱ,135℃下密閉反應30 min,反應結(jié)束后冷卻反應管;

(9)瓶 h中加入15 mL水,將反應液通過V15和 V17之間的 Sep Pak Al2O3和 Sep Pak C18小柱后進入廢液,并用氮氣吹干小柱。

(10)加入瓶i中的1 mL無水乙醇到反應管Ⅱ,經(jīng) Sep Pak Al2O3和 Sep Pak C18 后 ,加入0.1 mol/L硝酸鋅乙醇溶液2.31μL,密閉反應10 min后,70℃下濃縮溶液,至溶液完全蒸干,加入生理鹽水配置溶液,過無菌濾膜后接入產(chǎn)品瓶中。

3 結(jié)果與討論

3.1 [18F]FEDPA前體的合成

Hanshaw等[8]的合成路線是以3,5-二羥甲基苯酚為起始原料,經(jīng)過縮合、溴代、胺化、脫保護基等反應制備前體1。本工作分3部分合成了前體1:2-氰基吡啶經(jīng)過催化氫化制備二甲基吡啶胺(化合物3),收率30%;三乙二醇為起始原料,經(jīng)酯化、疊氮化、還原、Boc保護和取代反應制備化合物7;最后以化合物3、7、8,經(jīng)過四步反應完成了前體1的合成,并采用氨的甲醇溶液作為洗脫劑,得到目標前體1的純品,收率5%(以化合物4計)。在合成化合物7時,采用甲磺酰酯基替代原路線中的溴作為離去基團,提高了收率。

圖7 合成模塊的路線圖Fig.7 Scheme of disposable cassette

3.2 產(chǎn)物的鑒定分析

化合物 1:1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.51(d,4H,J=4.2 Hz),7.56～7.85(m,8H),7.11～7.14(m,4H),7.07(s,1H),6.89(s,2H),4.08～4.15(m,2H),3.86～3.89(m,2H),3.80(s,8H),3.70～3.74(m,2H),3.64(s,4H),3.53(t,2H,J=5.2 Hz),2.87(t,2H,J=5.2 Hz),2.08(s,2H)。

產(chǎn)品用 HPLC分析(Alltima C18,150 mm×4.6 mm,5μm),結(jié)果示于圖8。由圖 8可以看出,[18F]FEDPA的保留時間為11.9 min,標準品[19F]FEDPA的保留時間為11.6 min。放射化學純度為77%(乙腈/0.1 mol/L甲酸銨水溶液:30/70,流速為1 mL/min,254 nm UV檢測)。[18F]FEOTs在堿性條件下進行烷基化反應時,發(fā)生部分水解,致使采用Sep Pak C18小柱分離的方法純化后的產(chǎn)物中仍帶有部分水解產(chǎn)物,造成目標產(chǎn)物的放射化學純度較低。

圖8 [18F]FEDPA的放射性 HPLC圖譜(a)和FEDPA紫外 HPLC圖譜(b)Fig.8 Radioactive(a)and UV(b)chromatogram of the prepared FEDPA

3.3 氟化標記反應條件的選擇

在進行前體1的[18F]氟乙基化反應時,作者嘗試了很多反應條件,得到產(chǎn)物[18F]FEDPA的標記率都很低(表1)。

表1 不同條件下合成[18F]FEDPA的標記率Table 1 Radiochemical yield of[18F]FEDPAat different conditions

最后選定以DMF為溶劑,以 K2CO3為堿在135℃下反應30 min,得到[18F]FEDPA,標記率(8.9±0.3)%(n=2)。分析造成[18F]FEDPA放化收率低的主要原因是:(1)[18F]FEOTs的化學純度較低;(2)前體1的烷基化效率較低,且合成時間長,造成目標產(chǎn)物的標記率偏低,有待進一步優(yōu)化。

4 結(jié) 論

[18F]FEDPA是自行設計的一種檢測細胞凋亡的二甲基吡啶胺類PET顯像劑。本研究對前體1的全合成路線進行了改進,并以化合物1作為前體進行了18F標記制備[18F]FEDPA,合成時間是 105 min,標記率(8.9±0.3)%(經(jīng)校正,n=2),HPLC檢測放射化學純度為77%。

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Synthesis and Radiolabelling of[18F]FEDPA as an Imaging Agent for Apoptosis

GUO Xin-yan1,WANG Hong-liang1,J IN Yan-feng1,LIU Ying-hua1,TANG Gang-hua2,＊,J IANG Shen-de1,＊
1.School of Pharmaceutical Science and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;
2.PET-CT Center of Department of Nuclear Medicine,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China

Synthesis and fluoro-radiolabelling of apoptosis imaging agent[18F]FEDPA were reported.The labeling precursor 2-{2-[2-(3,5-bis(2,2’-dipicolyaminomeyhyl)-phenoxy)ethoxy]-ethoxy}ethyl amine was prepared with the total yield of 5%(based on compound 4).18F-labeling of the precursor gave[18F]FEDPA.The radiochemical yield is(8.9±0.3)%(n=2,decay corrected)and radiochemical purity is 77%determined by HPLC.

18F-labeling;apoptosis;[18F]FEDPA;synthesis

TL923

A

0253-9950(2011)04-0245-07

2010-09-02;

2010-12-21

國家自然科學基金資助項目(30970856);國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2008AA02Z430)

郭新艷(1985—),女,山東煙臺人,碩士研究生,藥物化學專業(yè)

＊通信聯(lián)系人:唐剛?cè)A,男,教授,博士生導師,主要從事放射性藥物與分子影像學研究,E-mail:gtang0224@yahoo.com.cn

姜申德,男,教授,博士生導師,主要從事有機合成研究,E-mail:jianggroup@tju.edu.cn