劉振鋒,趙 葵,董孟杰,王國(guó)林,楊樹(shù)業(yè)

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院PET中心,浙江杭州 310003

腫瘤乏氧顯像劑18F-FAZA的自動(dòng)化合成

劉振鋒,趙 葵,董孟杰＊,王國(guó)林,楊樹(shù)業(yè)

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院PET中心,浙江杭州 310003

為了制備1-α-D-[5’-脫氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑(18FAZA),采用兩鍋法與氟多功能模塊,以4～6 mg前體在115℃氟化反應(yīng)10 min,用C-18柱捕獲中間產(chǎn)物,用NaOH水解,HCl中和,進(jìn)行HPLC分離,得到18FAZA注射液體。總合成時(shí)間45 min,放化產(chǎn)率和放射化學(xué)純度分別大于10%與98%。采用兩鍋法自動(dòng)合成18F-FAZA,能夠滿(mǎn)足科研與臨床研究的需要。

乏氧;18F-FAZA;PET顯像

多數(shù)惡性腫瘤組織實(shí)質(zhì)生長(zhǎng)迅速,間質(zhì)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,導(dǎo)致腫瘤局部血供與需求失衡,發(fā)生缺氧;另外,惡性腫瘤代謝旺盛,消耗大量的氧,導(dǎo)致供血不足,使腫瘤局部處于乏氧狀態(tài)。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),乏氧不僅使腫瘤產(chǎn)生針對(duì)放、化療的保護(hù)蛋白,增加對(duì)放、化療的抵抗性,而且使腫瘤內(nèi)氧調(diào)節(jié)蛋白(ORP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等表達(dá)增加,從而使腫瘤自身的侵襲性也增加。腫瘤組織的乏氧程度決定了腫瘤對(duì)放療或化療的敏感程度,采用乏氧顯像劑,進(jìn)行 PET顯像,可以了解腫瘤的乏氧程度,并勾畫(huà)生物靶區(qū),制訂最有效的放化療方案。1-α-D-[5’-脫氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑(18FAZA)顯像劑[1-2]與18F-FMISO[3]相比,具有更快的血液與非靶組織清除率,18F-FMISO主要通過(guò)肝臟代謝,而18FAZA則主要經(jīng)腎臟排泄,腸道內(nèi)無(wú)放射性,腹部腫瘤18F-FAZA圖像應(yīng)優(yōu)于18F-MISO[4]。

Kumar等[5]對(duì)微波輔助下18FAZA的放射性制備做了初步研究,對(duì)放射標(biāo)記中的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)條件進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用微波技術(shù)標(biāo)記比常規(guī)放射性標(biāo)記的標(biāo)記率要高。Reischl等[6]對(duì)18FAZA應(yīng)用一鍋法進(jìn)行了18FAZA的自動(dòng)化合成,標(biāo)記溫度為100℃,標(biāo)記時(shí)間為5 min,產(chǎn)率為20%。18FAZA在國(guó)外已經(jīng)被合成并應(yīng)用到多種腫瘤的調(diào)強(qiáng)放療中,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到這方面的報(bào)道。應(yīng)用一鍋法合成18FAZA,由于反應(yīng)成分復(fù)雜,會(huì)影響合成的重復(fù)性與產(chǎn)品的純度。本研究應(yīng)用氟多功能模塊,采用兩鍋法,先用C-18柱對(duì)氟標(biāo)記的中間體進(jìn)行提純,再對(duì)其進(jìn)行堿水解,自動(dòng)化合成18FAZA,以改善合成的重復(fù)性與產(chǎn)品純度。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑和儀器

H218O,豐度95%,美國(guó) Isotec公司;4,7,13,16,21,24-六氧雜-1,10二氮雙環(huán)[8,8,8]二十六烷(K222),分析純,德國(guó) ABX公司;NaOH、HCl,分析純,乙醇為 HPLC級(jí),北京化工廠;二甲基亞砜(DMSO)、絕對(duì)無(wú)水乙腈,比利時(shí)Acros公司;硅膠板 ,英國(guó) Whatman 公司;1-α-D-[5’-O-對(duì)甲苯磺?；?2’、3’乙酰阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑 ,德國(guó) ABX公司;1-α-D-[5’-脫氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑,德國(guó)ABX公司;Sep-Pak QMA柱,C18 Sep-Pak柱,美國(guó)Waters公司。

RDS111加速器,美國(guó)CTI公司;雙反應(yīng)管18F多功能化學(xué)合成單元(chemistry process control unit,CPCU),北京派特生物有限公司;活度計(jì),美國(guó)Bioscan公司;Aligent 1200高效液相色譜、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱、G1314BVWD檢測(cè)器、G1328B手動(dòng)進(jìn)樣器、Flow-Count放射性檢測(cè)器(BioScan),分析柱為 Agilent eclipse SB-C18(5μm,4.6 mm×150 mm),美國(guó)Aligent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠,雌雄各半,體重18～22 g,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成路線(xiàn)

18FAZA的合成路線(xiàn)示于圖1。

圖1 18FAZA的放射化學(xué)合成路線(xiàn)Fig.1 Radiosynthesis of18FAZA

2.2 18F-F-的生產(chǎn)

采用RDS111醫(yī)用回旋加速器通過(guò)18O(p,n)18F核反應(yīng),用11 MeV、35μA的質(zhì)子束流連續(xù)轟擊靶15 min,用氣動(dòng)方式將18F-F-傳輸?shù)椒喙δ芎铣赡K(圖2)中,18F-F-被吸附到Sep-Pak light QMA柱上,等待被淋入反應(yīng)管中。

2.3 18FAZA的自動(dòng)化合成

用氟多功能合成模塊進(jìn)行18FAZA的放射化學(xué)合成,具體標(biāo)記操作如下:

(1)加速器生產(chǎn)的18F被QMA柱捕獲;

(2)用1號(hào)瓶中的1 mL溶液(12.5 mg K222加2.5 mg K2CO3溶于0.1 mL水和0.9 mL乙腈的混合溶液)將18F淋洗到反應(yīng)管中;

(3)將反應(yīng)管中的溶液于116℃氮?dú)獯蹈?

(4)反應(yīng)管中加入2號(hào)瓶中2 mL干燥乙腈,于116℃氮?dú)獯蹈?

(5)反應(yīng)管中加入3號(hào)瓶中5 mg FAZA前體和0.8 mL干燥DMSO,于115℃反應(yīng)10 min;

(6)反應(yīng)管中分3次加入5號(hào)瓶30 mL水,將混合液體通過(guò)V1與V2閥門(mén)之間的C-18柱,標(biāo)記中間體被捕獲在C-18柱上;

(7)反應(yīng)管中加入2 mL乙醇溶液,將C-18柱上的標(biāo)記物從反應(yīng)管1轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管2中;

(8)將反應(yīng)管2中溶液于120℃氮?dú)獯蹈?

(9)加入6號(hào)瓶中1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液水解2 min;

(10)加入7號(hào)瓶中1 mL 0.5 mol/L的 HCl溶液中和;

圖2 18FAZA的自動(dòng)合成裝置示意圖Fig.2 Scheme of disposable cassette of18FAZA

(11)將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到中轉(zhuǎn)瓶中,啟動(dòng) HPLC純化,Alltima C18柱(250 mm×10.0 mm,10μm);流動(dòng)相為V(乙醇) ∶V(水)=8∶92;流速4 mL/min。

2.4 產(chǎn)品的質(zhì)量控制

用精密p H試紙測(cè)定注射液的p H值,目測(cè)其顏色和澄清度;取即時(shí)制備的18FAZA注射液,用活度計(jì)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的活度值,用半對(duì)數(shù)作圖法估測(cè)半衰期和核純度;用 HPLC系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照鑒定產(chǎn)品,并用其與 TLC測(cè)定注射液的放射化學(xué)純度。HPLC分析條件:C-18分析柱,流動(dòng)相為10%的乙醇溶液,流速為1 mL/min,紫外(UV)檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;在室溫下,測(cè)定注射液在8 h內(nèi)不同時(shí)間的放化純度,觀測(cè)其穩(wěn)定性;TLC的條件為V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=9∶1。

2.5 產(chǎn)物的體外穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將所制備的18FAZA稀釋到37 GBq/L,取0.2 mL,加入到1 mL的小牛血清中,在37℃溫育,每隔2 h應(yīng)用 TLC測(cè)量產(chǎn)物的放射化學(xué)純度,觀察8 h后穩(wěn)定性,TLC的展開(kāi)劑為V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=9∶1。

2.6 18FAZA的異常毒性實(shí)驗(yàn)

KM小鼠(體重18～22 g,給藥前未禁食禁水)5只,尾靜脈注射18FAZA的注射液3.7×106Bq(0.5 mL),觀察48 h后處死并解剖。

3 結(jié)果和討論

3.1 18FAZA的合成

通過(guò)國(guó)產(chǎn)多功能模塊進(jìn)行乏氧顯像劑18FFAZA藥物的自動(dòng)化合成,總合成時(shí)間小于45 min,由于前體比較昂貴,選用少量的前體4～6 mg,不校正產(chǎn)率可大于10%(n=10),應(yīng)用制備型的 HPLC分離18FAZA,18FAZA的 HPLC的保留時(shí)間為12 min,隨著前體用量的增加,產(chǎn)率也增加(表1),當(dāng)前體量為15 mg時(shí),不校正產(chǎn)率可以達(dá)到25%;用干燥的乙腈做溶劑,在密閉條件下120℃反應(yīng)10 min,產(chǎn)率只有1%,可能是溶劑內(nèi)部溫度不如DMSO高的原因,用 HPLC級(jí)的DMSO進(jìn)行反應(yīng),沒(méi)有產(chǎn)物,原因是反應(yīng)必須在無(wú)水條件下進(jìn)行,水參與競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),因而得不到產(chǎn)物。與 Reischl等[6]采用一鍋法合成比較,本合成中采用兩鍋法合成18FAZA,可以先將親核標(biāo)記生成的中間體,初步捕獲到C-18柱上,除去 K222、DMSO、K2CO3等雜質(zhì),消除這些雜質(zhì)對(duì)下一步中間體進(jìn)行堿性水解的干擾,有效地提高了反應(yīng)的重復(fù)性,同時(shí)也使得最終產(chǎn)品經(jīng) HPLC提純更方便,純化后化學(xué)純度與放射化學(xué)純度更高。如果不用 HPLC分離提純,而采用固相萃取技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行快速的分離提純,合成時(shí)間將會(huì)大大縮短,合成產(chǎn)率將得到進(jìn)一步的提高,我們正在進(jìn)行這方面的探索。

表1 前體用量對(duì)不校正放化合成產(chǎn)率的影響Table 1 Radiochemical yield dependence on the amount of precursor without correct

3.2 18FAZA的質(zhì)量控制與穩(wěn)定性

18FAZA注射液為無(wú)色溶液,p H≈7.0,放射性濃度大于74 GBq/L,比活度不小于7.4×1010kBq/mol。用時(shí)間衰變法測(cè)定18F半衰期約為110 min,放射性核純度大于99%。HPLC鑒定測(cè)量結(jié)果示于圖3。由圖3看出,參比FAZA標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰(320 nm)與18FAZA放射性峰(tR=7.6 min)一致,為同一物質(zhì)(由于物質(zhì)先經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器,后經(jīng)放射性檢測(cè)器,兩者之間管線(xiàn)體積為0.3 mL,所以放射性tR比紫外tR時(shí)間滯留0.3 s)。18FAZA的 HPLC與放射性 TLC譜圖(圖4)顯示放射化學(xué)純度大于98%,TLC圖譜中18FAZA的Rf=0.75,未標(biāo)記的18F的Rf=0。18FAZA在小牛血清中8 h后,放射化學(xué)純度仍然大于96%,穩(wěn)定性良好。

圖3 FAZA的HPLC譜圖Fig.3 HPLC of FAZA

3.3 異常毒性檢查

尾靜脈給予18FAZA注射液后,觀察48 h,小鼠生長(zhǎng)正常,無(wú)死亡及不良反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生,解剖后觀察,未見(jiàn)任何器官損傷。

圖4 18FAZA的TLC譜圖Fig.4 TLC chromatogram of18FAZA

4 結(jié) 論

應(yīng)用兩鍋法,通過(guò)氟多功能模塊進(jìn)行乏氧顯像劑18F-FAZA藥物的自動(dòng)化合成,總合成時(shí)間小于45 min,放化產(chǎn)率和放射化學(xué)純度分別大于10%與98%,藥物的體外穩(wěn)定性良好,急毒性實(shí)驗(yàn)顯示藥品安全,利用該法自動(dòng)合成的18FAZA注射液能滿(mǎn)足科研和臨床PET顯像的需要。

[1]Piert M,Machala H J,Picchio M,et al.Hypoxia-Specific Tumor Imaging With18F-Fluoroazomycin Arabinoside[J].J Nucl Med,2005,46(1):106-113.

[2]Piert M,Machulla H-J,Kumar P,et al.18F Labeled Fluoroazomycinarabinoside(FAZA):A Novel Marker of Tumor Tissue Hypoxia[J].J Nucl Med,2001,42:1 091-1 100.

[3]Yeh S H,Liu R S,Wu L C,et al.Fluorine-18 Fluoromisonidazole Tumour to Muscle Retention Ratio for the Detection of Hypoxia in Nasopharyngeal Carcinoma[J].Eur J Nucl Med,1996,23:1 378-1 383.

[4]Sorger D,Patt M,Kumar P,et al.[18F]Fluoroazomycinarabinofuranoside(18FAZA)and[18F]Fluoromisonidazole(18FMISO):A Comparative Study of Their Selective Uptake in Hypoxic Cells and PET Imaging in Experimental Rat Tumors[J].Nucl Med Biol,2003,30:317-326.

[5]Kumar P,Wiebe L I,Asikoglu M,et al.Microwave-Assisted(Radio)Halogenation of Nitroimidazole-Based Hypoxia Markers[J].Appl Radiat Isot,2002,57:697-703.

[6]Reischl G,Ehrlichmann W,Bieg C,et al.Preparation of the Hypoxia Imaging PET Tracer[18F]FAZA:Reaction Parameters and Automation[J].Appl Radiat Isot,2005,62:897-901.

Automated Synthesis of18F-Labelled FAZA as Hypoxia Imaging Agent

LIU Zhen-feng,ZHAO Kui,DON G Meng-jie＊,WANG Guo-lin,YANG Shu-ye
PET Center,the First Affiliated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310003,China

1-(5-[18F]fluoro-5-deoxy-α-D-arabinofuranosyl)-2-nitroimidazole was synthesized by“two pot”method at a multifunctional CPCU made in China and by using 1-(2,3-di-O-acetyl-5-O-tosyl-α-D-arabinofuranosyl)-2-nitroimidazole as precursor.The precursor(4-6 mg)was fluorinated at 115℃for 10 min.The F-18 labeled intermediate was traped by a C-18 column,then was hydrolyzed using NaOH.The reaction mixture was neutralized by adding HCl,and was purified through HPLC.The pure18FAZA is obtained for no more than 45 min.The overall radiochemical yield is more than 10%,and the radiopurity is higher than 98%.18FAZA is successfully autosynthesized through“two pot”method.It can be used in clinical and scientific research.

hypoxia;18F-FAZA;positron emission tomography

R817.4

A

0253-9950(2011)03-0184-04

2010-09-02;

2010-12-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30870730);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生基金資助項(xiàng)目(2007A063);浙江省科技廳基金資助項(xiàng)目(2009C33109)

劉振鋒(1980—),男,山東德州人,碩士,主管藥師,主要從事正電子藥物研發(fā)

＊通信聯(lián)系人:董孟杰(1972—),男,山西萬(wàn)榮人,博士,主治醫(yī)師,從事正電子藥物研發(fā)與臨床研究