楊 鵬，李 云，張志勇，孫澤林，張立民，李群喜，陳 通，張?jiān)弃Q，劉清軍，鄒西峰，付愛(ài)軍，朱 軍

（1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山市 063007；2.河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山市 063007）

彌散性腦損傷（Diffuse brain injury，DBI）是閉合性腦外傷的一種，是神經(jīng)外科常見(jiàn)急癥之一，病情嚴(yán)重，致殘率及死亡率均高[1]。DBI后神經(jīng)損害不僅發(fā)生在損傷瞬間，且在其后的數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生的繼發(fā)性損傷也很嚴(yán)重[2]，幸存者通常有嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙。此外，DBI傷后還可出現(xiàn)神經(jīng)元延遲性死亡，從而導(dǎo)致患者長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙，極大地影響了患者生活質(zhì)量。神經(jīng)節(jié)苷脂（Ganglioside）是近來(lái)治療DBI的常用藥物，其腦保護(hù)作用和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用已引起人們關(guān)注。本研究擬采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)研究神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)大鼠DBI后認(rèn)知功能的改善作用，旨在為治療顱腦創(chuàng)傷患者提供新的理論基礎(chǔ)和治療途徑，改善顱腦創(chuàng)傷患者的預(yù)后。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YLS-3TB大鼠跳臺(tái)記錄儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；SLY-WMS Morris水迷宮分析系統(tǒng)（北京碩林苑科技有限公司）。

1.2 試藥

10%水合氯醛（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：20021109）；神經(jīng)節(jié)苷脂（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：20030508，規(guī)格：20 mg·2 mL－1），以生理鹽水稀釋至所需濃度備用。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠48只，♂，月齡4個(gè)月左右，體重310～390 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)：京動(dòng)許字20000006。動(dòng)物喂養(yǎng)在河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物中心，自然光照，自由進(jìn)食，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，不禁水。

2 方法

2.1 建模

根據(jù)Marmarou方法建立DBI模型[3]。于致傷前0.5 h，腹腔注射阿托品30 mg·kg－1。腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg－1麻醉大鼠，以75%乙醇消毒術(shù)區(qū)，沿正中矢狀線切開(kāi)頭皮，剝離骨膜，顯露冠狀縫及人字縫，固定打擊墊片在大鼠冠狀縫與人字縫之間，將大鼠俯臥位固定于海綿床墊（10×10×20 cm3）上。頭部固定于致傷架下，打擊錘自2 m高度自由落下，打擊后即刻移開(kāi)大鼠，以防止打擊錘造成的二次損傷。致傷后，去除打擊墊片，清創(chuàng)縫合傷口。保溫復(fù)蘇后繼續(xù)飼養(yǎng)。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和藥物干預(yù)組，每組12只，各組間大鼠月齡、體重分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常對(duì)照組不作任何處理；假手術(shù)組僅給予麻醉及頭皮切開(kāi)、縫合，但不致傷；模型組和藥物干預(yù)組均建立DBI模型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，藥物干預(yù)組建模后30 min即刻經(jīng)腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂40 mg·kg－1·d－1，其余3組在相同時(shí)間內(nèi)給予等量生理鹽水，之后每天于同一時(shí)間給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥14 d，末次給藥后取各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

各組大鼠接受不同處理措施前4天為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期。第1天讓大鼠自由游泳2 min，從第2天起，每天分上、下午2段，每段訓(xùn)練4次，訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，訓(xùn)練其在180 s內(nèi)找到安全平臺(tái)。如果大鼠在180 s內(nèi)未找到安全平臺(tái)，需將其引至安全平臺(tái)。每次訓(xùn)練間隔60 s。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)圖像追蹤系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠在訓(xùn)練前及訓(xùn)練后的活動(dòng)路線圖。經(jīng)過(guò)4 d的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，大鼠都能在180 s內(nèi)順利找到安全平臺(tái)。

訓(xùn)練完成后將大鼠分組，末次給藥后去掉安全平臺(tái)再次進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，將大鼠面向池壁，隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)放入池中，根據(jù)水迷宮實(shí)驗(yàn)圖像追蹤系統(tǒng)記錄結(jié)果，計(jì)算大鼠在180 s內(nèi)搜索安全平臺(tái)的次數(shù)、第1次穿過(guò)安全平臺(tái)的時(shí)間及在靶像限活動(dòng)時(shí)間，評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能。

2.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，將大鼠放入箱內(nèi)銅柵上，適應(yīng)5 min，隨后通電，大鼠受電擊，正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)大鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。從大鼠電擊后逃到安全臺(tái)上開(kāi)始記時(shí)，再?gòu)陌踩_(tái)上下來(lái)此段時(shí)間為潛伏期，大鼠從安全臺(tái)上再次跳下為錯(cuò)誤反應(yīng)。如果5 min內(nèi)大鼠未跳下平臺(tái)，錯(cuò)誤次數(shù)記錄為0次，潛伏期記為300 s。各組大鼠接受不同處理措施前1天為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期，末次給藥后重新測(cè)試各組大鼠，記錄潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)Excel數(shù)據(jù)庫(kù)整理后應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 建模結(jié)果

建模后，24只大鼠均出現(xiàn)呼吸抑制和心跳暫停，給予吸氧、人工呼吸、心臟胸廓按壓等搶救措施后，有9只呼吸心跳未能恢復(fù)，于傷后l h內(nèi)死亡，存活大鼠15只，死亡率為37.5%。所有模型大鼠均出現(xiàn)四肢劇烈抽搐，持續(xù)15～30 s，隨后，前肢呈去皮層屈曲，昏迷狀態(tài)，多于30 s內(nèi)恢復(fù)心跳和自主呼吸。存活大鼠于5～60 min內(nèi)清醒，前肢恢復(fù)正常。模型大鼠在72 h內(nèi)反應(yīng)遲鈍，而正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠活動(dòng)正常。

3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)訓(xùn)練前和訓(xùn)練后活動(dòng)路線圖見(jiàn)圖1。

圖1 正常大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)活動(dòng)路線圖A.訓(xùn)練前；B.訓(xùn)練后Fig 1 Morris water maze route map of normal ratsA.before training；B.after training

由圖1可知，正常大鼠在訓(xùn)練前第1次找到安全平臺(tái)的時(shí)間和路線均較長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，大鼠第1次找到安全平臺(tái)的時(shí)間和路線均較短，水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī)明顯提高。表明大鼠對(duì)安全平臺(tái)位置產(chǎn)生了一定的記憶。末次給藥后各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)活動(dòng)路線圖見(jiàn)圖2。

由圖2可知，正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī)相近，大鼠活動(dòng)路線集中在靶像限內(nèi)，表明大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受影響較??；而模型組和藥物干預(yù)組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī)較差，大鼠活動(dòng)路線分散在各個(gè)像限，表明大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受不同程度的影響。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組和藥物干預(yù)組大鼠第1次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，搜索安全平臺(tái)次數(shù)、在靶像限活動(dòng)時(shí)間均明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠第1次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間明顯縮短，搜索安全平臺(tái)次數(shù)、在靶像限活動(dòng)時(shí)間均明顯增加（P＜0.05）。各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較見(jiàn)表1。

圖2 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)活動(dòng)路線圖A.正常對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.藥物干預(yù)組Fig 2 Morris water maze route map of rats in each groupA.normal control group；B.sham operation group；C.model group；D.drug intervention group

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常對(duì)照組（n=12）假手術(shù)組（n=12）模型組（n=7）藥物干預(yù)組（n=8）F在靶像限活動(dòng)時(shí)間/s 123.51±5.91 118.28±5.10 61.38±8.67＊84.59±6.78＊#83.39第1次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間/s 4.62±0.58 5.28±0.71 10.15±1.35＊8.02±1.09＊#70.42搜索安全平臺(tái)次數(shù)/次10.1±1.9 10.3±1.8 3.8±2.3＊6.8±1.3＊#24.18

3.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組和藥物干預(yù)組大鼠潛伏期時(shí)間明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見(jiàn)表2。

4 討論

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，大鼠腦外傷后細(xì)胞凋亡高峰出現(xiàn)于傷后48 h，這種傷后神經(jīng)元的延遲性死亡，可導(dǎo)致長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了DBI后遲發(fā)性細(xì)胞死亡對(duì)大鼠認(rèn)知功能有一定影響，同時(shí)也提示在臨床上應(yīng)盡量減少DBI后的遲發(fā)性細(xì)胞死亡，從而減輕腦DBI后的認(rèn)知障礙。此外，本研究中正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)第14天搜索安全平臺(tái)次數(shù)的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可以排除頭皮切開(kāi)等應(yīng)激反應(yīng)對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

表2 各組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

表2 各組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

錯(cuò)誤次數(shù)/次4.8±1.2 4.6±1.5 9.7±2.8＊7.5±2.3＊#14.36分組正常對(duì)照組（n=12）假手術(shù)組（n=12）模型組（n=7）藥物干預(yù)組（n=8）F潛伏期/s 264.83±16.99 262.51±21.54 179.28±31.24＊230.46±24.63＊#25.33

神經(jīng)節(jié)苷脂是從牛腦中提取和純化的一種復(fù)合神經(jīng)節(jié)苷酯，臨床證明，其能明顯促進(jìn)外周神經(jīng)損傷、脊髓損傷和糖尿病神經(jīng)病變中受損神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)[7]；在腦缺血中早期有護(hù)腦作用，后期有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)作用，且具有周圍神經(jīng)鎮(zhèn)痛作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)組大鼠在180 s內(nèi)找到安全平臺(tái)的次數(shù)和在靶像限內(nèi)活動(dòng)時(shí)間明顯高于模型組大鼠（P＜0.05），第1次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間明顯低于模型組（P＜0.05），跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少。其原因可能為藥物干預(yù)組大鼠使用神經(jīng)節(jié)苷脂后，通過(guò)減少神經(jīng)元的凋亡，改善了大鼠的認(rèn)知能力。神經(jīng)節(jié)苷脂改善大鼠認(rèn)知能力的可能機(jī)制包括：（1）神經(jīng)節(jié)苷脂可促進(jìn)神經(jīng)元的軸突再生，刺激突觸形成、激發(fā)細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶的活性，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化過(guò)程并改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度，從而改善大鼠認(rèn)知功能；（2）神經(jīng)節(jié)苷脂具有較強(qiáng)的修復(fù)神經(jīng)組織損害的潛力，能加速神經(jīng)支配功能的恢復(fù)。

本研究證實(shí)了神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)DBI模型大鼠認(rèn)知能力有改善作用，這也提示在DBI后應(yīng)盡早使用促進(jìn)神經(jīng)組織恢復(fù)的藥物，以改善患者的預(yù)后。

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