王 楊，高 輝，黃云昆，付曉野，徐 敏（昆明市延安醫(yī)院檢驗科，昆明市 650051）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）廣泛分布于自然界，屬于條件致病菌，在正常人體內(nèi)很少致病，卻是醫(yī)院感染的重要病原菌之一。隨著新型廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，PA對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性日益嚴重，限制了抗菌藥物的選擇，給臨床抗感染治療帶來了極大的困擾。本研究收集我院臨床標本中分離的26株P(guān)A，通過研究其所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的基因型及耐藥性特點，為進一步研究昆明地區(qū)PA耐藥基因的分布情況奠定基礎(chǔ)，為減少耐藥PA的產(chǎn)生、提高臨床抗感染治療效果提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

VITEK32型全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國Biometra公司）；PowerPac Basic電泳儀和Laboratovies 6000凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 菌株

2009年6月－2009年12月我院檢驗科臨床標本中分離的非重復性PA26株；質(zhì)控菌：大腸埃希菌（ATCC25922）和銅綠假單胞菌（ATCC27853）均由云南省臨檢中心提供。

1.3 試藥

藥敏試驗用M-H培養(yǎng)基和亞胺培南、環(huán)丙沙星藥敏紙片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品；哌拉西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、復方磺胺甲唑（復方新諾明）、左旋氧氟沙星藥敏紙片均為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；基因擴增試劑盒（Taq PCR MasterMix）（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）；PCR擴增引物（北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成）。

2 方法

2.1 細菌鑒定與藥敏試驗

細菌鑒定采用全自動細菌鑒定儀進行鑒定。藥敏試驗采用瓊脂紙片擴散（Kirby-Bauer）法檢測細菌對我院16種常用的抗菌藥物（亞胺培南、環(huán)丙沙星、哌拉西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、復方磺胺甲唑（復方新諾明）、左旋氧氟沙星藥敏紙片）的耐藥性。具體方法：用接種環(huán)挑取菌落制備成0.5 cfu·mL－1的菌液均勻涂布于藥敏試驗用M-H平板上，再貼上對應(yīng)抗菌藥物的藥敏紙片（每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平板邊緣不少于15 mm），置于35℃溫箱內(nèi)孵育18～24 h，按2008年版美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的標準根據(jù)抑菌圈的直徑大小來判定菌株對該抗菌藥物的耐藥率、中介率和敏感率。

2.2 提取細菌基因組DNA

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA作為模板，按試劑盒說明書操作。

2.3 基因檢測

用PCR儀擴增7種β-內(nèi)酰胺酶基因，7種靶基因引物序列見表1[1]。

表1 PCR引物序列表Tab 1 PCR primer

PCR擴增體系均為：Taq PCR Master Mix溶液25 μL，模板0.5 μL，P1 引物2 μL，P2引物 2 μL，無菌去離子水補足至50 μL。熱循環(huán)參數(shù)均為：94℃、2 min，然后94℃、60 s→55℃、60 s→72℃、60 s，循環(huán)35個周期，最后72℃、10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，與DNA分子量標準進行比較，凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有表1中相同產(chǎn)物長度的產(chǎn)物。

2.4 基因序列測定與分析

β-內(nèi)酰胺酶基因擴增的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后，送北京博邁德科技發(fā)展有限公司用ABI 377型全自動DNA序列分析儀進行序列測定，所測序列參照美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫進行序列比對和同源性分析。

3 結(jié)果

3.1 細菌鑒定結(jié)果

結(jié)果表明，我院檢驗科臨床標本中分離的26株細菌均為PA。

3.2 藥敏試驗結(jié)果

26株P(guān)A對16種抗菌藥物的耐藥性，見表2。

由表2可知，除慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素以外，26株P(guān)A對12種常用抗菌藥物有不同程度的耐藥性。

表2 26株P(guān)A對16種抗菌藥物的耐藥性分析結(jié)果Tab 2 Drug-resistant rate of 26 strains of PA to 16 kinds of antimicrobial drugs

3.3 β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測結(jié)果

26株P(guān)A均檢測出TEM基因，其中5株P(guān)A的基因擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。而SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1基因擴增結(jié)果均為陰性。

圖1 TEM基因擴增產(chǎn)物的電泳圖Fig 1 Electrophorogram of TEM gene amplified products

3.4 序列分析及比對

由于諸多原因，本研究僅對6個菌株的TEM基因PCR陽性產(chǎn)物進行了雙向測序，共測得523個核苷酸。該序列與Gen-Bank DNA序列數(shù)據(jù)庫里的β-內(nèi)酰胺酶TEM-1的編碼基因同源性為99%，由于6個菌株的結(jié)果基本一致，故只選取了1個菌株的測序結(jié)果見圖2。

4 討論

PA是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，其對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性呈逐年上升趨勢，且在各個國家和地區(qū)流行的β-內(nèi)酰胺酶基因型各有不同[2，3]。

圖2 某一PA菌株中TEM基因PCR產(chǎn)物測序圖Fig 2 DNA sequencing for PCR product of TEM gene of some PAstrain

本研究中的26株P(guān)A均檢測出TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因，與國內(nèi)其他地區(qū)的檢測結(jié)果有一定差別[4，5]。導致菌株β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶率不同的原因可能與菌株來源（地理位置）和各地區(qū)醫(yī)院抗菌藥物的使用習慣不同有關(guān)。TEM-1是革蘭陰性菌中最常見的一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶，能水解青霉素和低代頭孢菌素（如頭孢噻吩和頭孢噻啶等）。在新一代抗菌藥物濫用等因素的影響下，細菌的β-內(nèi)酰胺酶基因突變，可由廣譜酶TEM-1、TEM-2結(jié)構(gòu)序列發(fā)生1～5個氨基酸改變而衍生出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，能水解廣譜青霉素、第3代頭孢類及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。目前已發(fā)現(xiàn)了160種TEM型衍生酶，均呈酸性，等電點為5.2～6.5，其中大部分是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶[6，7]。藥敏結(jié)果顯示，本組PA對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物都有不同程度的耐藥，尤其對頭孢哌酮和氨曲南的耐藥率更分別高達73.1%和42.3%。本組26株P(guān)A所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶可能主要為TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶。而昆明地區(qū)PA的β-內(nèi)酰胺酶基因型除TEM-1型外，是否存在其他基因型，其流行率如何，本課題組正在進行深入研究。

此外，藥敏試驗顯示，該組PA不僅對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類、磺胺類和喹諾酮類等其他抗菌藥物也存在很高的耐藥率。PA表現(xiàn)為多重耐藥，其機制非常復雜，研究[8]發(fā)現(xiàn)細菌可通過基因變異或基因水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，除產(chǎn)生各種β-內(nèi)酰胺酶外，還可產(chǎn)生抗菌藥物修飾酶、外排泵高表達、藥物作用靶位改變和外膜通透性改變等。

PA對同一種類抗菌藥物的耐藥通常不是由單一因素造成的，而是幾種機制協(xié)同作用的結(jié)果，其對不同種類抗菌藥物的耐藥機制也各有不同，還不斷有新的耐藥機制出現(xiàn)，而且同一菌種在不同地區(qū)、不同時期其耐藥性和耐藥基因的攜帶狀況也不盡相同[8，9]。因此，檢測當?shù)豍A的耐藥率及耐藥基因流行情況，對于及時發(fā)現(xiàn)突變株、指導臨床合理使用抗菌藥物、預防和控制感染具有重要意義。

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