劉春美，吳曉峰，潘 揚(yáng)，蔣亞平，張 弦（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京市 210029）

巴豆（Crotonis Fructus）為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的成熟果實(shí)，載于現(xiàn)行《中國藥典》中[1]。巴豆大毒，其毒性主要為兩類成分，一類是脂肪油（巴豆油），含量達(dá)60%，既是毒性成分又是有效成分，口服后在腸內(nèi)析出游離巴豆酸，使腸道分泌和蠕動(dòng)增強(qiáng)，產(chǎn)生峻瀉；另一類是蛋白質(zhì)（巴豆毒素），能溶解紅血球，使局部細(xì)胞壞死[2，3]。由于遇熱可使這兩類毒性成分含量降低或變性失活，因此目前通常采用取仁通過蒸、煮制熟后去油制霜（巴豆霜）的炮制方法，對(duì)緩和巴豆的毒性有積極意義[4，5]。但傳統(tǒng)炮制法操作較煩瑣，霜內(nèi)含油量多少均憑經(jīng)驗(yàn)觀察，各地結(jié)果不一，差距很大，無法保證用藥安全[6]。在應(yīng)用巴豆制品治病的過程中，由于其有效劑量與中毒劑量比較接近，安全系數(shù)低，在無血藥濃度監(jiān)測(cè)的情況下，如用之不當(dāng)或服用過量，不但起不到藥物應(yīng)發(fā)揮的作用，有時(shí)反而還可能引起中毒甚至有生命危險(xiǎn)[7，8]。鑒于炮制對(duì)巴豆減毒存在的缺陷，有必要尋找新的解決這類問題的好途徑。

“雙向發(fā)酵”是南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所創(chuàng)立的一種使藥用真菌與藥材間組合進(jìn)行固體發(fā)酵的方法[9]，它為毒性中藥減毒開辟了一條新途徑[10，11]。本試驗(yàn)對(duì)靈芝菌與白僵菌2種巴豆發(fā)酵品與生巴豆及傳統(tǒng)炮制品（巴豆霜）中毒性成分總蛋白和脂肪油含量及主要成分的含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明，巴豆經(jīng)靈芝菌和白僵菌發(fā)酵后，其毒性成分脂肪油和總蛋白的含量明顯降低，且均低于巴豆霜；經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析，巴豆發(fā)酵品、生巴豆和巴豆霜的脂肪油中共鑒定出48種成分。與生巴豆相比，2種發(fā)酵品脂肪油成分的組成和相對(duì)含量產(chǎn)生了明顯變化；且出現(xiàn)了新成分，其中靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)中各有5種。以上結(jié)果可為發(fā)酵對(duì)巴豆的“去毒存效”奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 6890N型GC儀、5973N型MS檢測(cè)器、7683 serise自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent色譜工作站配NIST05標(biāo)準(zhǔn)MS檢索庫（PaloAlto，CA，USA）；UV-2401紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AE 240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；202型臺(tái)式恒溫干燥箱（上海索譜儀器有限公司）；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.2 試藥

生巴豆產(chǎn)自云南，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為大戟科植物C.tiglium L.的果實(shí)，標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所（批號(hào)：20081145）；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司進(jìn)口分裝，批號(hào)：A8010）；考馬斯亮藍(lán)G-250（美國Amresco公司進(jìn)口分裝，批號(hào)：0615）；95%乙醇、磷酸均為分析純。

1.3 菌種

靈芝菌[Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.）P.Karst.]和白僵菌[Beauveria bassiana（Bals.）Vuill]均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所分離、貯藏和復(fù)壯。

2 方法

2.1 試液的配制

2.1.1 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備[12]精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，加入95%乙醇50 mL，再加入85%（W/V）磷酸100 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，即得。2.1.2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 精密稱取牛血清白蛋白100 mg，用少量蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，即得濃度為0.1 mg·mL-1的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.2 靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)的制備

按固體發(fā)酵的生產(chǎn)工藝進(jìn)行操作[13]。將生巴豆（果實(shí)）粉碎成粗粒（過10目篩），加適量水濕潤，填裝試管，混合均勻，扎口，121℃高壓滅菌50 min，冷卻；從菌種斜面上分別切取綠豆粒大小的靈芝菌和白僵菌菌絲體（帶培養(yǎng)基）各1塊，移入待發(fā)酵生巴豆的表面（使二者有接觸），扎口，置培養(yǎng)箱中，于（27±2）℃下恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵30 d后分別掏取試管中的發(fā)酵物，60℃下干燥4～6 h，即分別得靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)。

2.3 脂肪油含量測(cè)定

取上述各巴豆樣品粗粒2 g，粉碎成粗粉（過20目篩），分別精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚100 mL，水浴回流提取至脂肪油提盡（約8 h），收集提取液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，于水浴上低溫?fù)]去溶劑，100℃干燥1 h，移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定，計(jì)算樣品中脂肪油含量[1]。

2.4 總蛋白含量測(cè)定[12]

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL刻度試管中，先用蒸餾水補(bǔ)足體積至1 mL，搖勻，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，放置5 min。然后以第一份為空白對(duì)照，于593 nm波長處測(cè)定吸光度。以濃度（c，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為A＝6.990 89c－0.000 91（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，總蛋白濃度在0.02～0.10 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 樣品含量測(cè)定 精密稱取各樣品0.5 g，置50 mL容量瓶中，加20 mL蒸餾水，置震蕩器中震蕩提取2 h（150 r·min-1），3 600 r·min-1離心10 min，濾過，濾渣再加20 mL蒸餾水，置震蕩器中震蕩提取1 h（150 r·min-1），3 600 r·min-1離心10 min，合并濾液，定容至50 mL容量瓶中，即得樣品溶液。精密吸取各樣品溶液1.0 mL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，于593 nm波長處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總蛋白含量（%）。

2.5 脂肪油的GC-MS測(cè)定

2.5.1 儀器工作條件 色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：氦氣（純度99.99%），流速：1.0 mL·min-1；分流模式進(jìn)樣，分流比為20∶1；程序升溫：初始溫度設(shè)定為50℃，以5℃·min-1升至210℃，維持3 min，再以5℃·min-1升溫至250℃，維持5 min。質(zhì)譜電離方式：EI源；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；接口溫度：280℃；溶劑延遲時(shí)間：2.5 min；電子倍增器電壓：1 623 V；質(zhì)量掃描范圍：m/z 40～500。

2.5.2 樣品的GC-MS分析 精密稱取巴豆油70 mg，加6 mL硫酸-甲醇（1∶10）混合溶液，于60℃水浴回流4 h（甲酯化），加10 mL水使樣品液冷卻，再加6 mL正己烷振蕩萃取，分離上清液，過濾，無水硫酸鈉干燥，低溫濃縮至干。殘?jiān)颖谷芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，有機(jī)相針式濾器（13 mm×0.45 μm）過濾，低溫密閉保存。取樣品溶液1 μL，按儀器工作條件注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定；對(duì)各樣品總離子流圖中化學(xué)色譜峰通過GC-MS分析工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)圖庫進(jìn)行檢索并參照有關(guān)文獻(xiàn)[14，15]進(jìn)行初步鑒定，按峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)百分含量。

3 結(jié)果

3.1 脂肪油和總蛋白的含量測(cè)定

各樣品中脂肪油測(cè)定結(jié)果表明：生巴豆＞巴豆霜＞靈巴菌質(zhì)＞白巴菌質(zhì)；總蛋白測(cè)定結(jié)果表明：生巴豆＞巴豆霜＞白巴菌質(zhì)＞靈巴菌質(zhì)。提示巴豆經(jīng)靈芝菌和白僵菌發(fā)酵后，其毒性物質(zhì)脂肪油和蛋白質(zhì)的含量明顯降低，且均低于巴豆霜，詳見表1。

表1 生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)中脂肪油與總蛋白含量測(cè)定結(jié)果Tab 1 Fatty oil and total protein contents in crude C.tiglium，defatted C.tiglium seed powders，LBJZ and BBJZ

3.2 脂肪油成分的GC-MS分析

GC-MS分析結(jié)果顯示，從生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質(zhì)、白巴菌質(zhì)中分別鑒定出39、24、36、42種成分，其中歸一化相對(duì)含量＞1%的共有16種化合物：生巴豆占11種，巴豆霜有12種，靈巴菌質(zhì)占8種，白巴菌質(zhì)占13種。在2種發(fā)酵品中還發(fā)現(xiàn)有新出現(xiàn)的成分，其中靈巴菌質(zhì)有5種，分別為4-癸烯酸甲酯、十五酸甲酯、7，10-十六碳二烯酸甲酯、7-十六碳烯酸甲酯、（Z）-9-十六碳烯酸甲酯；白巴菌質(zhì)也有5種，分別為壬醛、4-癸烯酸甲酯、十四烷酸、十五酸甲酯、7-十六碳烯酸甲酯。而生巴豆中的十九（烷）酸甲酯則未在發(fā)酵品中發(fā)現(xiàn)。各樣品脂肪油GC總離子流圖見圖1；各成分定性定量分析結(jié)果見表2。

圖1 各樣品脂肪油GC的總離子流圖（峰號(hào)參照表2）A.巴豆；B.巴豆霜；C.靈巴菌質(zhì)；D.白巴菌質(zhì)Fig 1 TIC of GC chromatograms of Fatty oil of samples（peak number referring to table 2）A.crude C.tiglium；B.defatted C.tiglium seed powders；C.LBJZ；D.BBJZ

表2 生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)脂肪油成分的定性定量分析結(jié)果Tab 2 Qualitative and quantitative analysis of the fatty oils in crude C.tiglium，defatted C.tiglium seed powders，LBJZ and BBJZ

續(xù)表2Continued tab 2

4 討論

巴豆經(jīng)靈芝菌、白僵菌雙向固體發(fā)酵后，其毒性成分脂肪油與總蛋白含量均有所下降，且低于巴豆傳統(tǒng)炮制品巴豆霜。所得脂肪油甲酯化后經(jīng)GC-MS法分析結(jié)果表明，靈巴菌質(zhì)和白巴菌質(zhì)與生巴豆及其炮制品相比，無論在脂肪油成分種類還是相對(duì)含量上均存在一定差異。這為進(jìn)一步探討巴豆發(fā)酵品“去毒存效”的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。至于巴豆中脂肪油與蛋白質(zhì)組成成分變化同其藥效之間的相關(guān)性及其生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：74-75.

[2] 夏麗英.現(xiàn)代中藥毒理學(xué)[M].第1版.天津：天津科技翻譯出版公司，2005：204.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（上冊(cè)）[M].第1版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1977：503.

[4] 徐楚江，葉定江.中藥炮制學(xué)（供中藥專業(yè)用）[M].第1版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：176.

[5] 張靜修，王 毅.生、熟巴豆對(duì)比實(shí)驗(yàn)[J].中藥材，1992，15（9）：29.

[6] 天津市藥材公司中藥研究室.巴豆霜制法的研究[J].中草藥通訊，1974，3：27.

[7] 時(shí)霄霄.巴豆過敏性休克1例[J].中國中藥雜志，1994，19（9）：569.

[8] 孫云成.腹腔注入巴豆冰片液致死1例[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1994，14（2）：4.

[9] 莊 毅，潘 揚(yáng)，張李陽，等.藥用真菌“雙向發(fā)酵”的起源、發(fā)展及其優(yōu)勢(shì)與潛力[J].中國食用菌，2007，26（2）：3.

[10] 涂 霞，潘 揚(yáng).雙向發(fā)酵——毒性中藥炮制減毒的新途徑[J].菌物研究，2010，8（1）：52.

[11] 王身艷，潘 揚(yáng)，蔣亞平，等.雙向發(fā)酵對(duì)川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響[J].中國藥房，2010，21（39）：3 712.

[12] 趙英永，戴 云，崔秀明，等.考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，15（3）：235.

[13] 徐錦堂.中國藥用真菌學(xué)[M].第1版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：230.

[14] 胡 靜，高文遠(yuǎn)，凌寧生，等.巴豆和巴豆霜揮發(fā)性成分的GC-MS分析[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：464.

[15] 梁 英，潘英明.巴豆種子油的GC-MS分析[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2002，19（6）：748.