顧媛，程利花，姜金斗，楊金寶，錢文斌b，吳菁嵐b，應(yīng)漢杰b

（1.南京工業(yè)大學(xué)a.生物與制藥工程學(xué)院；b.國家生化工程技術(shù)研究中心，南京 210009；2.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150086）

毛細(xì)管電泳法檢測嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

顧媛1a，程利花1a，姜金斗2，楊金寶2，錢文斌1ab，吳菁嵐1ab，應(yīng)漢杰1ab

（1.南京工業(yè)大學(xué)a.生物與制藥工程學(xué)院；b.國家生化工程技術(shù)研究中心，南京 210009；2.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150086）

建立了準(zhǔn)確簡便的測定嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，樣品經(jīng)脫脂、酸法去除酪蛋白和硫酸銨沉淀富集、纖維素濾膜過濾凈化等方法進(jìn)行預(yù)處理，選擇直徑為50 μm，有效長度為57 cm的未涂層毛細(xì)管柱進(jìn)行檢測，緩沖溶液為濃度40 mmol/L的硼酸鹽/磷酸鹽（pH值為9.5）,濃度為50 mmol/L的SDS,濃度為20 mmol/L的Brij35,體積分?jǐn)?shù)4%異丙醇,濃度為30 mmol/L硫酸鈉，工作電壓為18 kV，檢測波長為200 nm。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9992；平均回收率為92.8%，6次樣品測定RSD為2.4%。

乳鐵蛋白；毛細(xì)管電泳；嬰幼兒配方奶粉

0 引言

乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是1960年由Johannson從人乳中分離獲得的一種鐵結(jié)合性多功能糖蛋白[1，2]。在GB 2760食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，乳鐵蛋白可以在嬰兒配方奶粉、較大嬰兒和幼兒配方奶粉中使用，使用量為30～100 mg/100 g。目前國內(nèi)外報(bào)道的LF檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[3]、高效液相色譜法[4-5]和高效毛細(xì)管電泳法[6，7]，但這些方法大都適用于牛初乳或者是原料中的高質(zhì)量分?jǐn)?shù)LF的檢測，而關(guān)于嬰幼兒奶粉中LF的檢測方法報(bào)道較少。杜凌等人用酶聯(lián)免疫法來檢測嬰幼兒奶粉中的LF[8]，但是該法穩(wěn)定性差，產(chǎn)生的誤差較大，不適用于精密定量分析。本文建立了一種毛細(xì)管電泳法來檢測嬰幼兒奶粉中的LF，該方法拓寬了毛細(xì)管電泳法檢測LF的適用范圍，適于嬰幼兒奶粉中低質(zhì)量分?jǐn)?shù)LF的測定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

市售嬰幼兒配方奶粉；乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為90%)；硫酸銨，鹽酸，四硼酸鈉、磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氯化鈉，硫酸鈉均為分析純。十二烷基磺酸鈉（SDS），Brij35（聚氧乙烯月桂醚），異丙醇。實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。

1.2 儀器

貝克曼P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀，冷凍離心機(jī)，pH計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理[5]

準(zhǔn)確稱取10 g嬰幼兒奶粉樣品，使其完全溶解于100 mL水中，然后以5 000 r/min速度離心30 min，去除上層漂浮的脂肪；再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.6，用濾紙過濾。取一定量的濾液，然后緩慢攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，將溶液靜止3 h，以5 000 r/min速度離心30 min，取上清液，再向上清液中緩慢攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，將溶液靜止3 h，以5 000 r/min速度離心30 min，取沉淀，用10 mL去離子水溶解，再用0.45 μm纖維素濾膜過濾至樣品瓶內(nèi)，搖勻后供毛細(xì)管電動色譜測定。

1.3.2 毛細(xì)管柱的處理[9]

毛細(xì)管柱（50 μm×57 cm）第一次使用前用濃度為1 mol/L氫氧化鈉洗15 min，再用超純水洗5 min，后用電泳緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用濃度為0.05 mol/L氫氧化鈉和緩沖液沖洗5 min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用三重蒸餾水溶于25 mL容量瓶中，然后依次稀釋至2.0，1.0，0.75，0.50，0.375，0.25和0.10 g/L，并用0.45 μm纖維素濾膜過濾后用于色譜測定。

1.5 色譜條件

色譜柱為毛細(xì)管柱（50 μm×57 cm）；柱壓為18 kV；柱溫為25℃；檢測器為二極管陣列檢測器；檢測波長為200 nm；進(jìn)樣時(shí)間為10 s；檢測緩沖液pH值為9.5，濃度為40 mmol/L硼酸鹽/磷酸鹽+50 mmol/LSDS+20 mmol/LBrij35+體積分?jǐn)?shù)4%異丙醇+30 mmol/L硫酸鈉。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測緩沖液的確定

2.1.1 緩沖液種類及濃度的確定

緩沖液的種類是影響乳鐵蛋白分離的重要因素，考察了磷酸鹽與硼酸鹽緩沖液對分離的影響，發(fā)現(xiàn)使用單一的硼酸鹽緩沖體系和單一的磷酸鹽緩沖體系，峰會集中在一較小的區(qū)間內(nèi)，且不少峰出現(xiàn)重疊，分離度不佳，重現(xiàn)性差。實(shí)驗(yàn)著重考察了二元緩沖體系。磷酸鹽-硼酸鹽二元緩沖體系可以使分析窗口擴(kuò)大，緩沖容量增大，且在較高濃度下亦不會產(chǎn)生過大電流，對未知物的干擾影響小。實(shí)驗(yàn)考察了在20，30，40 mmol/L濃度下的緩沖鹽對分離度的影響。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，保留時(shí)間會延長，但是分離度會變好，所以選擇40 mmol/L濃度下的硼酸鹽/磷酸鹽溶液作為最適緩沖液。

2.1.2 表面活性劑及濃度的確定

表面活性劑在MECC中起著極其重要的作用，單獨(dú)以SDS作為添加劑，分析物的分離效果較差。若加入Brij35，則會改善其分離度。但是表面活性劑的濃度不能過低，也不能過高，否則會降低分離度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50 mmol/L的SDS和20 mmol/L的Brij35濃度下，分離度最好。

2.1.3 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的確定

因?yàn)楸砻婊钚詣┲械腟DS常常會產(chǎn)生泡沫，從而使組分在電泳過程中產(chǎn)生大量的焦耳熱，降低遷移時(shí)間的重復(fù)性，使各組分區(qū)帶增寬。加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，能使SDS所起的泡沫消泡，減少焦耳熱，提高遷移時(shí)間的重復(fù)性，對提高分離度有明顯的效果。高體積分?jǐn)?shù)的異丙醇削弱了樣品分子與表面活性劑的作用，使分離度降低，應(yīng)控制在體積分?jǐn)?shù)為4%左右為佳。

2.1.4 硫酸鈉鹽分濃度的確定

在緩沖液中加入一定量的陽離子中性鹽能夠改善分離度，并改善峰型，加入硫酸鈉還可以改變膠束的大小和形狀，并且可以增加膠束的疏水性。但是加入過多的鈉鹽會使分離時(shí)間延長，并且產(chǎn)生過大的焦耳熱，對基線造成抖動漂移等影響。實(shí)驗(yàn)考察了濃度為20，30，40 mmol/L硫酸鈉的影響，最終選擇濃度為30 mmol/L的硫酸鈉，該濃度下的硫酸鈉使得分離度較佳，基線較平穩(wěn)。

2.2 緩沖液pH值的確定

實(shí)驗(yàn)在硼酸鹽/磷酸鹽緩沖液的有效緩沖范圍內(nèi)研究了pH值變化對分離的影響，當(dāng)pH值小了，各種蛋白電泳遷移率的差異過小，導(dǎo)致組分峰重疊嚴(yán)重；當(dāng)pH值大了，緩沖液中OH-濃度急劇增加，電流增大，焦耳熱效應(yīng)是分離效率反而下降。因此，實(shí)驗(yàn)考察了pH值為8.5，9.0，9.5，10.0對分離度的影響，結(jié)果pH值為9.5時(shí)分離度最好。

2.3 乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以LF的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以LF在200 nm處的紫外吸收峰面積為縱坐標(biāo)，作乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示，由此計(jì)算出的回歸方程為y=998768x-4082，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，LF溶液在質(zhì)量濃度為0.1～2.0 g/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

圖1 乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品測定的色譜圖

乳鐵蛋白標(biāo)樣、嬰幼兒配方奶粉中LF的CE圖譜如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可以看出，乳鐵蛋白出峰時(shí)間在23 min左右。

2.5 方法回收率

準(zhǔn)確稱取3組嬰兒配方奶粉，分別添加不同濃度的乳鐵蛋白，每組3個(gè)平行，按1.3.1節(jié)方法處理樣品，進(jìn)樣檢測，結(jié)果如表1所示。

2.6 方法精密度

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對同一種添加乳鐵蛋白的嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行6次測定，處理方法用1.3.1，結(jié)果如表2所示。由表2經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，測定結(jié)果的重現(xiàn)性較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，測定結(jié)果穩(wěn)定。由此可見，本方法用于實(shí)驗(yàn)室檢測比較穩(wěn)定。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg/g

3 結(jié)論

本文建立了毛細(xì)管電泳法檢測嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量的方法。乳鐵蛋白的提取采用脫脂、酸法去除酪蛋白和硫酸銨沉淀富集的方法，確保最大限度的去除雜質(zhì)，且不會使蛋白質(zhì)變性。毛細(xì)管電動色譜條件上采用了內(nèi)徑為50 μm，長度57 cm的毛細(xì)管柱，在適宜的檢測緩沖液和檢測條件下，使得乳鐵蛋白和其它雜質(zhì)能很好地分離開。該方法方便、準(zhǔn)確、靈敏度高、穩(wěn)定且分離度好，是快速檢測嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白含量較適合的分析方法，而且解決了一直難以用常規(guī)HPLC法來分析嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量的準(zhǔn)確定量問題，這為今后嬰幼兒配方奶粉的安全檢測及乳鐵蛋白的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

[1]JOHANSSON B G.Isolation of an Iron Containing Red Protein from Human Milk[J].Acta Chem Scand,1960,14:510-512.

[2]LEVAY P F,VILJOEN M.Lactoferrin:A General Review[J].Haematologica,1995,80:252-267.

[3]馮挺財(cái)，邵譜，胡珩，等.牛乳鐵蛋白直接競爭ELISA檢測法的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(18)：7650-7652，7761.

[4]任璐，龔廣予，杭鋒，等.采用HPLC測定乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的方法研究[J].中國乳品工業(yè)，2009，37（2）：49-52.

[5]DRACKOVA M,BORKOVCOVA I,JANSTOVA B,et al.Determination of Lactoferrin in Goat Milk by HPLC Method[J].Czech Journal of Food Sciences,2009,27:102-104.

[6]RIECHEL P,WEISS T,WEISS M,et al.Determination of the Minor Whey Protein Bovine Lactoferrin in Cheese Whey Concentrates with Capillary Electrophoresis[J].Journal of Chromatography A,1998,817: 187-193.

[7]孫國慶，康小紅，劉衛(wèi)星，等.利用毛細(xì)管電泳法測定乳品中乳鐵蛋白含量[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（1）：115-117.

[8]杜凌，任璐，蘇米亞.嬰兒奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2008（3）：121-122.

[9]RIECHEL P,WEISS T,ULBER R,et al.Advances in Lactoferrin Research[M].Hannover,Germany:Plenum Publishing Corp,1998:33-39.

Determination of Lactoferrin in infant formula milk powder by Capillary Electrophoresis

GU Yuan1a,CHENG Li-hua1a,JIANG Jin-dou2,YANG Jin-bao2,QIAN Wen-bin1ab,WU Jing-lan1ab, YING Han-jie1ab
(1.Nanjing University of Technology a.College of Biotechnology And Pharmaceutical Engineering;b.National Biochemical Engineering Technique Research Center Nanjing 210009,China;2.National Dairy Produce Quality Inspection Center,Haerbin 150086,China)

An accurate and convenient method was developed for the determination of lactoferrin in infant formula milk powder.The pretreatment of sample was to degrease,remove caseins by adjusting pH to enrich LF with ammonium sulfate and clean up with Millipore,then using an uncoated capillary that the diameter was 50 μm and the effective length was 57 cm;buffer solution was 40 mmol/L borate/phosphate (pH=9.5),50 mmol/L SDS,20 mmol/L Brij35,4%isopropanol,30mmol/L Na2SO4;separated voltage was 18 kV;detection wavelength was 200 nm.Results showed that the relative coefficient was 0.9992,the average recovery was 92.8%;the RSD in 6 samples by testing was 2.4%.

lactoferrin;capillary electrophoresis;infant formula milk powder

TS252.7

A

1001-2230（2011）05-0054-03

2011-01-10

顧媛（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閶胗變耗谭壑腥殍F蛋白的檢測。

應(yīng)漢杰