姜侃，張東雷，金燕飛，陳小珍

（浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013）

乳品中腸球菌LAMP快速檢測方法的建立及應(yīng)用

姜侃，張東雷，金燕飛，陳小珍

（浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013）

應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP），針對腸球菌16sRNA中高度保守的序列分析設(shè)計特異性引物，建立乳品中腸球菌特異性快速檢測方法。結(jié)果表明，所設(shè)計的引物具有良好特異性，10株腸球菌均能擴增出特異性片段，而14株非腸球菌均未擴增出相應(yīng)片段，無假陰性或假陽性情況出現(xiàn)。同時，該方法可在14 h內(nèi)完成檢測，且陽性LAMP反應(yīng)所需目標菌DNA濃度僅為10 fg/μL。應(yīng)用本方法對164份嬰幼兒配方乳粉的檢測結(jié)果顯示，共在37個批次中檢出腸球菌，檢出率為22.6%，污染量在0.36～110 g-1（最近似值）間。該方法為腸球菌的快速檢測提供了一種重要的技術(shù)手段。

腸球菌；LAMP；快速檢測；乳品

0 引言

腸球菌（Enterococcus）屬鏈球菌科，是人類和動物腸道的正常菌群，既往認為其對人類無害，但近年研究和臨床病例已證實了腸球菌的致病性。腸球菌可引起食物中毒，常見中毒食品有乳及乳制品、肉制品等。目前腸球菌的檢測主要以傳統(tǒng)平板分離鑒定方法為主，檢測周期較長。目前，一種新穎的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop–MediatedIsothermalAmplification, LAMP）已逐步應(yīng)用于致病菌、病毒、轉(zhuǎn)基因食品等的檢測[1-3]。該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識別靶DNA上6個特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（BstDNA），在恒溫條件下快速、高效、特異地擴增核酸[4]。本研究針對腸球菌16sRNA中高度保守序列分析設(shè)計特異性引物設(shè)計引物組，建立了腸球菌LAMP快速檢測方法，并應(yīng)用至乳品檢測。

1 實驗

1.1 菌株

糞腸球菌（Enterococcus faecalis），菌種號CICC 10396和CICC 23536；屎腸球菌（Enterococcus faecium），菌種號CICC 10396和EF-1；耐久腸球菌（Enterococcus durans），菌種號CICC 22577；盲腸腸球菌（Enterococcus cecorum），菌種號CICC 21607；海氏腸球菌（Enterococcus hirae），菌種號CICC 21606；鳥腸球菌（Enterococcus avium），菌種號ATCC 49462；酪黃腸球菌（Enterococcus casselifavus），菌種號ATCC 49604；雞腸球菌（Enterococcus gallinarum），菌種號ATCC 49608；產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），菌種號ATCC 13124；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），菌種號ATCC 6538；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），菌種號CMCC 50115；福氏志賀氏菌（Shigella flexneri），菌種號ATCC 12022；痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae），菌種號ATCC 51252；宋內(nèi)志賀氏菌（Shigella sonnei），菌種號ATCC 25931；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes），菌種號ATCC 19114；英諾克李斯特菌（Listeria innocua），菌種號ATCC 33090；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），菌種號VP-1；溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolyticus），菌種號CMCC 32210；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌種號ATCC 15442；大腸埃希氏菌（Escherichia coli），菌種號ATCC 25922；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌種號BC-1；阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），菌種號ATCC 51329。

1.2 試劑與儀器

細菌基因組DNA抽提試劑盒，BstDNA聚合酶，10×Buffer，MgCl2、dNTP，甜菜堿，SYBR GreenⅠ，DNA Marker DL2000，Premix Ex Taq PCR預(yù)混液，瓊脂糖，電泳儀，自動凝膠電泳成像系統(tǒng)，PCR儀，恒溫水浴器。

1.3 引物

腸球菌引物設(shè)計以GenBank HQ259726.1為基礎(chǔ)，并參考GenBank AB470333.1、GenBank FJ845008.1、GenBankHQ293088.1、GenBankGU904689.1、Gen-BankFJ844983.1、GenbankNR_037082.1、GenBank HM446253.1等16sRNA基因序列，具體引物序列如表1所示。表1中，引物序列均經(jīng)BLAST驗證。所有引物均由Invitrogen公司合成。將各引物配制成濃度為50 μmol/L的溶液，備用。

表1 腸球菌LAMP檢測引物組

1.4 菌種純化

腸球菌接種于腸球菌肉湯，36℃培養(yǎng)24 h；產(chǎn)氣莢膜梭菌接種皰肉肉湯培養(yǎng)基，36℃厭氧培養(yǎng)24 h；溶血性鏈球菌和單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯，副溶血弧菌接種于3%氯化鈉緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液，其余菌種接種于營養(yǎng)肉湯，36℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液提取細菌DNA。

1.5 細菌DNA提取

細菌DNA提取采用細菌組DNA抽提試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書。

1.6 LAMP反應(yīng)

LAMP反應(yīng)體系為25 μL，組分如表2所示。將反應(yīng)液置于恒溫水浴鍋中，61℃反應(yīng)60 min。

表2 LAMP反應(yīng)體系組成

1.7 PCR方法的建立

PCR引物采用CPa-F3和CPa-B3，反應(yīng)體系如表3所示。目的片段長度為205 bp。反應(yīng)條件：95℃（5 min），95℃（30 s），55℃（30 s），72℃（30 s），30個循環(huán)，72℃（5 min），4℃保存。

表3 PCR反應(yīng)體系組成

1.8 LAMP特異性驗證

應(yīng)用10株腸球菌和14株非腸球菌，提取其基因組DNA進行LAMP檢測，分別應(yīng)用電泳（瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0.5×TBE、2.0%瓊脂糖凝膠、150 V電壓條件下電泳30 min）、離心（6 000 r/min以上離心5 min）或加熒光顯色劑（加入SYBR GreenⅠ）后觀察擴增結(jié)果，驗證該方法檢測腸球菌的種屬特異性。

1.9 LAMP和PCR方法的靈敏度比較

以糞腸球菌標準菌株CICC 10396為參考菌株，對本文中LAMP檢測方法和PCR檢測方法分別進行靈敏度測定，并對二者靈敏度進行比較。具體操作步驟為：將腸球菌標準菌株DNA提取液進行10倍梯度稀釋，使DNA質(zhì)量濃度約為10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，0.1 fg/μL；應(yīng)用以上DNA模板分別進行LAMP檢測和PCR檢測，電泳觀察結(jié)果，判斷并比較二者的檢測靈敏度。

1.10 模擬樣品的比對試驗

1.10.1 模擬樣品的制備

食品基質(zhì)分別采用液體乳和乳粉。將糞腸球菌標準菌株CICC 10396接種于腸球菌肉湯培養(yǎng)液，36℃培養(yǎng)24 h。腸球菌培養(yǎng)液均勻混合于液體和固體模擬樣品，使樣品中的污染量達到103mL-1，作為模擬陽性樣品。另將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌培養(yǎng)液均勻混合于其它樣品中，作為模擬陰性樣品。

1.10.2 模擬樣品的檢測

將模擬樣品分別以兩種方法檢測。第一種方法中，將25 g模擬樣品加入225 mL腸球菌肉湯培養(yǎng)液中，36℃培養(yǎng)12 h后，應(yīng)用試劑盒提取培養(yǎng)液中細菌DNA，采用LAMP方法進行檢測；第二種方法中，將模擬樣品按照行業(yè)標準[5]的方法進行定性檢測，并對兩組組檢測結(jié)果進行比對。

1.11 真實樣品的定性和定量檢測

1.11.1 定性檢測

應(yīng)用LAMP方法，對164批次嬰幼兒配方乳粉進行腸球菌檢測，具體檢測方法為：將25 g樣品加入225 mL腸球菌肉湯培養(yǎng)液中，36℃培養(yǎng)12 h后，應(yīng)用試劑盒提取培養(yǎng)液中細菌DNA，采用LAMP方法進行檢測。同時將這164批次樣品按照行業(yè)標準[5]的方法進行定性檢測，并對二者檢測結(jié)果進行比較。

1.11.2 定量檢測

對1.11.1中檢出腸球菌的樣品，采用最近似值測定法進行定量檢測。樣品的前處理及接種按照行業(yè)標準進行，選擇的培養(yǎng)液為腸球菌肉湯。對于36℃培養(yǎng)24 h后呈黑色的培養(yǎng)管，提取培養(yǎng)液中細菌DNA，采用LAMP方法進行確證，并參考行業(yè)標準附錄B給出最近似值。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴增

用該方法對10株腸球菌基因組DNA進行LAMP擴增。擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示，10株腸球菌均有明亮階梯狀目的條帶；擴增產(chǎn)物離心結(jié)果如圖2所示，腸球菌擴增產(chǎn)物均呈現(xiàn)明顯沉淀；擴增產(chǎn)物熒光顯色結(jié)果如圖3所示，腸球菌擴增產(chǎn)物均呈現(xiàn)強熒光。同時，檢測結(jié)果顯示，14株非腸球菌菌株DNA均未擴增出相應(yīng)產(chǎn)物，說明本方法具良好特異性。

圖1 腸球菌及非腸球菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖1中，1和16泳道為DNA marker；2～6和17～21泳道為10株腸球菌LAMP擴增結(jié)果；7～15和22～26泳道為非腸球菌LAMP擴增結(jié)果，依次為產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、副溶血弧菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌和阪崎腸桿菌。

圖2 腸球菌和非腸球菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物離心后結(jié)果

圖2中，1～10號管為腸球菌標準菌株；11～24號反應(yīng)管依次分別為依次為產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、副溶血弧菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌和阪崎腸桿菌。

圖3 腸球菌和非腸球菌LAMP產(chǎn)物熒光染色結(jié)果

圖3中，1～6號管為腸球菌標準菌株；7～16號管依次為金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌、單增李斯特菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌和阪崎腸桿菌。

2.2 靈敏度實驗

以不同的腸球菌標準菌株DNA模板質(zhì)量濃度對LAMP方法和普通PCR方法的檢測靈敏度進行測試。其中LAMP方法檢測時，當DNA模板質(zhì)量濃度降至10 fg/μL時仍可見較為明亮的梯狀擴增產(chǎn)物，故LAMP法靈敏度達到10 fg/μL；PCR法檢測時，當DNA模板質(zhì)量濃度降至10 pg/μL時仍可見較為明亮的目的擴增片段，故PCR法檢測靈敏度約為10 pg/μL。在本實驗中，LAMP檢測方法的靈敏度較普通PCR方法高3個數(shù)量級，體現(xiàn)出更好的檢測靈敏度。

圖4 腸球菌LAMP檢測靈敏度

圖4中，1泳道為DNA marker，11泳道為空白對照；2～10泳道分別為10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/ μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，0.1 fg/μL模板DNA質(zhì)量濃度的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。

圖5 腸球菌PCR檢測靈敏度測試

圖5中，1泳道為DNA marker；1～10泳道分別為10 ng/μL,1 ng/μL,100 pg/μL,10 pg/μL,1 pg/μL, 100 fg/μL,10 fg/μL,1 fg/μL,0.1 fg/μL模板DNA質(zhì)量濃度的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。

2.3 模擬樣品檢測比對實驗

對模擬樣品LAMP檢測結(jié)果與預(yù)期完全一致，且與國家標準方法的檢測結(jié)果完全吻合，無假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，說明該方法具有良好的特異性和實用性。同時，LAMP檢測方法檢測周期僅為14 h，較國家標準分析方法3 d的檢測周期有明顯改善。

2.4 真實樣品檢測比對實驗

應(yīng)用LAMP方法對164批次嬰幼兒配方乳粉進行腸球菌定量檢測，在37批次樣品中檢出腸球菌，檢出率為22.6%，與行業(yè)標準方法的檢測結(jié)果一致，污染量（最近似值）在0.36～110g-1間（表4）。

表4 嬰幼兒配方乳粉腸球菌定量檢測結(jié)果

3 討論

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，但研究和臨床病例已證實了腸球菌的致病性，由腸球菌引起的食物中毒事件屢有發(fā)生[6-8]，當食入每克含菌量達105以上的污染食品時，即可引起食物中毒，而針對嬰幼兒等特殊人群時，引起食物中毒的污染量可能更低。衛(wèi)生學(xué)家認為，腸球菌類似于大腸菌群的生態(tài)活動，但對外環(huán)境抵抗力更強，作為監(jiān)測水質(zhì)衛(wèi)生，環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量的污染指標更具有衛(wèi)生學(xué)意義。長期以來，食品中腸球菌的檢測主要采用平板培養(yǎng)分離鑒定法，但該方法檢測周期長達3 d，且檢測過程較為復(fù)雜，無法及時提供檢測數(shù)據(jù)。近年來，有關(guān)腸球菌的檢測技術(shù)及分型研究已進入分子水平[9,10]，這為腸球菌所致食物中毒的防控提供重要技術(shù)指導(dǎo)。

PCR方法盡管操作起來比較簡單易行，但是操作過程必須有高精密度的溫度循環(huán)裝置，從而使得這種方法不能在實地現(xiàn)場廣泛應(yīng)用。LAMP技術(shù)無需高精密度溫控設(shè)備，可在恒定溫條件下，1 h內(nèi)擴增出109靶序列拷貝，擴增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物，可通過電泳觀察是否顯現(xiàn)階梯式圖譜，或離心觀察是否出現(xiàn)沉淀，或加入熒光顯色劑觀察是否呈現(xiàn)熒光來判斷檢測結(jié)果。LAMP技術(shù)以其特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點，在諸如致病菌、病毒、霉菌、轉(zhuǎn)基因成分等食品安全檢測領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。

本研究結(jié)果表明，所建LAMP檢測方法特異性強，穩(wěn)定性好，目標菌DNA的檢出限達到10 fg/μL，較PCR方法靈敏度提高1 000倍。在對164份嬰幼兒配方乳粉腸球菌的檢測結(jié)果顯示，其中37批次被腸球菌污染，證實了腸球菌在乳品中污染的存在。因此，對于污染率較高的樣本，如食物中毒樣本可以無需增菌而通過直接制備菌懸液提取DNA的方式獲得模板，本LAMP檢測方法的靈敏度完全能夠滿足檢測要求；對于污染程度較低的樣品，可通過使用腸球菌肉湯培養(yǎng)液對樣品在36℃條件下增菌10～12 h，細菌濃度即可滿足LAMP檢測要求。同時，LAMP檢測結(jié)果觀察方式簡便多樣，檢測設(shè)備要求不高，具有廣闊應(yīng)用前景，特別適用于基層單位及食品安全突發(fā)事件的現(xiàn)場檢測，有利于從源頭控制食品安全事件的發(fā)生。

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Establishment of LAMP rapid detection method for Enterococcus in dairy products

JIANG Kan,ZHANG Dong-lei,JIN Yan-fei,CHEN Xiao-zhen
(Zhejiang Test Academy of Quality and Technical Supervision,Hangzhou 310013，China)

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)rapid detection method for Enterococcus in dairy products was established,with the LAMP primers designed based on the 16sRNA sequence.The results of the study indicated that the method had perfect specificity,as 10 strains of Enterococcus were able to amplify specific fragments,while 14 strains of non-Enterococcus were not,and no false positive or false negative results occurred.The test could be done within 14 hours,and the concentration of target bacteria DNA for positive LAMP reaction was only 10 fg/μL of sample DNA.The established method was applied to the test of 164 Infant formula milk powders,and 37 had positive result,with the amount of pollution between 0.36～110 MPN/g.The established method provides a good choice for rapid detection of Enterococcus.

Enterococcus；LAMP；rapid detection；dairy

TS252.7

B

1001-2230（2011）05-0050-04

2011-03-15

浙江省科技廳優(yōu)先主題重點社會發(fā)展項目（No.2009C13013）；浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研項目（No.20090209）。

姜侃（1978-），男，工程師，研究方向為免疫學(xué)與微生物學(xué)。

張東雷