李秋琴，王世杰，陸淳，于景華

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221）

乳酸菌高密度培養(yǎng)及其在產(chǎn)品中保持高密度的研究

李秋琴1，王世杰2，陸淳2，于景華1

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221）

制備高密度菌數(shù)含量的活性乳酸菌飲料和高活性乳酸菌制劑的一個(gè)重要前提是實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度培養(yǎng)，另則是采取一定的方法保持產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)乳酸菌的活性與數(shù)量。綜述了國內(nèi)外不同乳酸菌高密度培養(yǎng)的技術(shù)和現(xiàn)狀，以及如何防止產(chǎn)品益生菌活力下降的措施。

乳酸菌；高密度培養(yǎng)；菌活力

0 引言

益生菌產(chǎn)品的擴(kuò)大和其功效備受關(guān)注。2003年歐洲食品與飼料菌種協(xié)會(huì)（EFFCA）定義益生菌為：指當(dāng)攝入充足的數(shù)量后，對(duì)宿主產(chǎn)生一種或多種有論證的功能性健康益處的微生物，強(qiáng)調(diào)了益生菌的數(shù)量是其發(fā)揮益生功效的前提。益生菌攝入量達(dá)108個(gè)/天的水平[1]，可起到降低某些腸道疾病的發(fā)病率、持續(xù)時(shí)間和病情嚴(yán)重性的效果，所以，無論是乳酸菌飲料還是益生菌酸奶或是微生態(tài)制劑，實(shí)現(xiàn)益生菌體的高密度是首要條件。

也有大量實(shí)驗(yàn)表明，益生菌在牛奶中的生長不好，加上冷藏過程死亡的部分，造成發(fā)酵奶中的數(shù)量較低，而數(shù)量是其起到保健功能的前提，因此高密度培養(yǎng)和產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)降低菌體死亡率的研究才是一套完整的乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)。

1 乳酸菌高密度培養(yǎng)的優(yōu)化策略

1.1 菌種

在生產(chǎn)高密度高活性益生菌發(fā)酵乳制品和微生態(tài)制劑時(shí)，我們面臨著眾多的挑戰(zhàn)。益生菌在運(yùn)載系統(tǒng)中的存活率決定于菌株的選擇；菌種間的互作；代謝產(chǎn)物的生成量，產(chǎn)品的最終酸度等一些因素。對(duì)于高密度培養(yǎng)，菌種本身的特性是影響高密度的一個(gè)首要因素，因此選擇合適的菌株是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，由于菌種的不同，其所能達(dá)到的最高濃度將受到很大的影響。

目前國內(nèi)外學(xué)者主要對(duì)如下乳酸菌進(jìn)行了高密度培養(yǎng)的研究（見表1）。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基成分的選擇一直是改善乳酸菌生長的手段，經(jīng)常使用增菌培養(yǎng)基包括配制培養(yǎng)基（如MRS、M17等）、乳基質(zhì)培養(yǎng)基、乳清基質(zhì)培養(yǎng)基，后兩者常常配合以其他生長因子方可使用，除此之外，酵母粉、蛋白胨和乳蛋白，乳清粉，大麥粒等的復(fù)合培養(yǎng)基也常用于乳酸菌的培養(yǎng)[17，18]。

國內(nèi)對(duì)于乳酸菌高密度培養(yǎng)的研究主要集中于增殖培養(yǎng)基的研究方面，對(duì)于各種乳酸菌增殖培養(yǎng)基的研究報(bào)道很多，包括優(yōu)化的合成培養(yǎng)基，在MRS或M17等合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良以達(dá)到增殖的目的；添加各種提取物或植物蛋白作為增殖因子，如番茄汁、平菇汁、肝浸汁、胡蘿卜汁、海帶汁、麥芽汁、玉米漿、燕麥片等[19-22]。吳祖芳通過添加番茄汁培養(yǎng)Lactobacillus H17，明顯有促進(jìn)菌體生長的作用[9]。蛋白水解活力影響乳酸菌的增殖速度，因此水解大豆蛋白也作為一個(gè)增殖因子[3]。李丹丹驗(yàn)證了牛蒡菊糖對(duì)雙歧桿菌有明顯增殖作用[23]。另外LAB合成能力有限，需要多種氨基酸和維生素維持生存。

表1 高密度培養(yǎng)的菌株

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件控制主要是指對(duì)培養(yǎng)溫度、pH值和對(duì)氧氣的需求值等可能對(duì)乳酸菌生長產(chǎn)生影響的環(huán)境因素的控制。許多研究者在進(jìn)行乳酸菌高密度培養(yǎng)時(shí)都要考察菌株的最適生長溫度，馮鎮(zhèn)等的兩段式變溫培養(yǎng)乳酸菌的研究，認(rèn)為變溫培養(yǎng)比單一培養(yǎng)生物量和發(fā)酵活力都有所提高[24]。乳酸菌生長的最適pH值也因種屬和來源的不同而有差異，許多研究表明乳球菌的最適生長pH值在6.0～6.3；乳桿菌在微酸性環(huán)境中生長更好，大多數(shù)情況下最大比生長速率通常在pH值5.5～6.0。國外學(xué)者對(duì)雙歧桿菌的研究表明光對(duì)其生長也有一定的影響[25]。

1.4 乳酸菌培養(yǎng)模式及控制

乳酸菌依靠代謝碳源產(chǎn)生乳酸的途徑來獲取能量，隨著菌體的繁殖，乳酸不斷產(chǎn)生并導(dǎo)致pH值降低，達(dá)到一定程度時(shí)，即使?fàn)I養(yǎng)成分充足也會(huì)抑制乳酸菌的進(jìn)一步生長，因此如何克服乳酸的抑制作用是實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵，目前國內(nèi)外關(guān)于乳酸菌HCDC，都是圍繞著如何減輕低pH值和乳酸積累對(duì)菌體的抑制展開研究,目前有以下幾種方法：

1.4.1 培養(yǎng)基緩沖鹽法

緩沖鹽法是向乳酸菌的培養(yǎng)液中加入緩沖鹽，以調(diào)節(jié)和控制培養(yǎng)液的酸度使其pH保持一定的范圍，促進(jìn)乳酸菌的生長繁殖。乳品加工廠一般采用緩沖鹽有檸檬酸鹽、磷酸鹽，乳蛋白也有一定的緩沖作用。馮友軍等[26]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%檸檬酸(鈉)，5%乙酸(鈉)和2%丙酮酸鈉按一定比例復(fù)合而成的緩沖體系使乳酸菌菌體培養(yǎng)的發(fā)酵終濃度從2.22×108mL-1提高到1.32× 109mL-1。由于緩沖鹽的緩沖作用有一定的范圍而有所限制。

1.4.2 中和劑法

中和劑法是通過流加堿液中和乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸，解除低酸度的抑制作用。該法簡便易行，用于產(chǎn)酸菌高密度培養(yǎng)，是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。常用的中和劑有NaOH、氨水、Na2CO3等。閔偉紅等人用堿性中和和分批補(bǔ)料的復(fù)合作用使保加利亞乳桿菌達(dá)到9.02×1011mL-1的高濃度[4]。研究表明對(duì)于植物乳桿菌一般化學(xué)中和劑法比緩沖鹽法更利于其生長[27]。

由于進(jìn)行pH值控制培養(yǎng)時(shí)，加入堿液，一方面引起營養(yǎng)培養(yǎng)基的稀釋，一方面導(dǎo)致乳酸鹽的積累，無法從根本上去除高濃度乳酸、乳酸鹽的抑制作用。

1.4.3 補(bǔ)料分批培養(yǎng)法

補(bǔ)料分批培養(yǎng)（又稱流加培養(yǎng)）指在發(fā)酵開始后或者分批培養(yǎng)的某些階段以某種方式間歇地或連續(xù)地補(bǔ)加一種或幾種新鮮培養(yǎng)基，延長菌體生長時(shí)間的培養(yǎng)方式?？煞譃閮煞N基本模式：無反饋調(diào)節(jié)和反饋控制調(diào)節(jié)。在幾種高密度培養(yǎng)方法中，補(bǔ)料分批技術(shù)研究得最廣泛也最常用，可分為4種類型：間歇培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，指數(shù)添加培養(yǎng)，饋料式培養(yǎng)，在分批培養(yǎng)中主要是通過控制溫度、pH值、培養(yǎng)基成分及其流加速度來達(dá)到高密度。Zhang Y[28]等人研究了pH值反饋調(diào)節(jié)添加培養(yǎng)基生產(chǎn)乳酸的方法，乳酸產(chǎn)量、干細(xì)胞重比一次性培養(yǎng)分別有所提高，此方法簡單，容易操作，工業(yè)化可利用。

在產(chǎn)物(或副產(chǎn)物)不會(huì)對(duì)菌體生長和產(chǎn)物形成造成強(qiáng)烈抑制時(shí)補(bǔ)料分批技術(shù)有很好的應(yīng)用價(jià)值，培養(yǎng)過程發(fā)酵液中的活菌密度較低，為其不足之處。

1.4.4 萃取發(fā)酵

萃取發(fā)酵是通過原位去除發(fā)酵代謝產(chǎn)物來降低抑制的方法。乳酸菌發(fā)酵代謝的一些產(chǎn)物尤其是乳酸使得其所處的環(huán)境惡化，抑制了菌體的生長，萃取發(fā)酵正是利用了這個(gè)原理，但由于萃取液對(duì)菌體有影響而且在萃取的過程中會(huì)損失一些菌體細(xì)胞，這方面的報(bào)道很少。

1.4.5 固定化法

固定化方法是將活細(xì)胞固定在某種載體上，然后將載體至于培養(yǎng)體系中，以達(dá)到高密度培養(yǎng)。細(xì)胞固定化載體微生物生長提供了充足的的空間，保證了生物反應(yīng)器內(nèi)較高的細(xì)胞濃度使得反應(yīng)速度加快，從而有較高的生產(chǎn)力，且細(xì)胞被固定不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞流失現(xiàn)象，固定化細(xì)胞可多次重復(fù)使用，防止?fàn)I養(yǎng)基質(zhì)的浪費(fèi)，但對(duì)于好氧菌來說，O2是其瓶頸。

Doleyres Y[17]研究長雙歧桿菌利用結(jié)凝膠固定化進(jìn)行培養(yǎng)，得出固定化培養(yǎng)菌體數(shù)是細(xì)胞懸浮的9.5倍。Yang S T等[29]人研究了通過纖維填充床反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體，利用纖維固定細(xì)胞，比在液體懸浮液中的細(xì)胞有更高的活力和低凋亡率，并且纖維基質(zhì)可有選擇性的保留健康的、無凋亡的細(xì)胞，排出凋亡的和死的細(xì)胞，保證了長期培養(yǎng)的穩(wěn)定性，認(rèn)為此反應(yīng)器在達(dá)到高細(xì)胞密度，生產(chǎn)力，產(chǎn)物濃度方面有很好的效果，早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用很有潛力。

1.4.6 透析培養(yǎng)

透析培養(yǎng)通過半透膜有效地去除培養(yǎng)液中有害的小分子代謝產(chǎn)物，而只保留細(xì)胞和高分子產(chǎn)物，同時(shí)向培養(yǎng)液中提供新鮮營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方法。最熟悉的例子就是Osborne在1977年首次將透析用于乳酸桿菌培養(yǎng)，獲得了1×1011mL-1的高菌體密度,相當(dāng)于30～40 g/L[30]。

透析培養(yǎng)采用提供營養(yǎng)的營養(yǎng)液和維持滲透壓的無機(jī)鹽溶液分開的分配模式，可達(dá)到較高的菌體密度，也減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失，且透析培養(yǎng)過程中透析膜不易被阻塞。但是由于其設(shè)備組件投資較大，不易應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

1.4.7 細(xì)胞循環(huán)連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法是通過某種方式將細(xì)胞保留在培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)方法，和固定化法有一些相似之處，細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法可以通過膜過濾、沉降、離心的方式將細(xì)胞保留[31]。膜過濾培養(yǎng)是在普通培養(yǎng)裝置上附加一套膜過濾系統(tǒng)，用泵將培養(yǎng)液強(qiáng)制流過膜，把菌體截留，濃縮后的培養(yǎng)液返回反應(yīng)器中，再添加新鮮培養(yǎng)基。膜過濾培養(yǎng)除去生長抑制物或代謝阻遏物不損失細(xì)胞；相比固定化細(xì)胞培養(yǎng)不存在傳質(zhì)阻力。

隨著膜技術(shù)的廣泛應(yīng)用，膜組件及裝備和集成技術(shù)也得以迅速發(fā)展和不斷完善，然而膜的污染和劣化始終是制約膜技術(shù)發(fā)展的瓶頸之一。早在1988年前分批培養(yǎng)就應(yīng)經(jīng)商業(yè)化了，且成為當(dāng)時(shí)的唯一，而透析培養(yǎng)和細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)由于其操作難點(diǎn)和附加設(shè)備而沒實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[32]。國內(nèi)膜生物反應(yīng)器的發(fā)展還不成熟，這方面的報(bào)道很少，陸愛華等對(duì)中空膜纖維組件在乳酸菌的高密度培養(yǎng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討，結(jié)果顯示中空膜纖維組件在乳酸菌的高密度培養(yǎng)的應(yīng)用方面還存在一定問題，有待于進(jìn)一步研究[33]。韓亦龍對(duì)陶瓷微濾膜的研究中，因受到過濾時(shí)操作條件的限制，導(dǎo)致過濾時(shí)死亡率太高[34]。

2 延長乳酸菌存活期的方法

高活性乳酸菌制品的前提是要對(duì)乳酸菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，另外保持其活性及在活性乳制品中的存活率也是非常重要的，然而由于益生菌的自身生長特性及周圍環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致進(jìn)入市場的產(chǎn)品中活菌含量很低。因此，如何提高乳品中益生菌活菌數(shù)量已成為商業(yè)中的重點(diǎn)研究課題。

影響發(fā)酵乳中益生菌的存活的因素有菌株、pH值、過氧化氫、存儲(chǔ)環(huán)境、乳酸和乙酸代謝物的含量、溶解氧量、緩沖液等[35]。提高益生菌穩(wěn)定性的方法：菌株的選擇，溶氧量的控制，微囊化，應(yīng)激適應(yīng)，添加促生長因子，緩沖液，包裝材料的選擇等。

2.1 菌株的選擇

大部分“益生菌”缺乏耐酸性，難以抵抗胃液的強(qiáng)酸作用，根本無法到達(dá)腸道發(fā)揮作用。有學(xué)者篩選出一些耐酸性較強(qiáng)的菌種[36]或者通過一些方法例如紫外線誘變菌種使其耐酸，不同的菌株在酸和膽汁中的生存狀況不一樣，如6種雙歧桿菌菌株中，長雙歧桿菌和假長雙歧桿菌對(duì)酸的耐受性最好；長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌對(duì)膽汁的耐受性最好；而嬰兒雙歧桿菌在酸性條件下存活率非常低[37]。所以選擇合適的耐酸耐膽鹽的菌株，有助于提高發(fā)酵乳中益生菌的生存能力。

2.2 溶氧量的控制

氧毒性被認(rèn)為是導(dǎo)致酸乳中益生菌存活數(shù)量損失的重要因素，且一般認(rèn)為雙歧桿菌非常容易受到氧氣的影響[38]。Miller等發(fā)現(xiàn)在酸乳貨架期中的溶氧持續(xù)增長情況下，雙歧桿菌的數(shù)量較好的保持在建議的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)106之上，這與我們通常的雙歧桿菌嚴(yán)格厭氧易受到氧毒害的觀點(diǎn)矛盾[39]。雖然氧毒性被廣泛認(rèn)為與酸乳中的益生菌的低存活有關(guān)，但是沒有很好的證據(jù)來支持它。

現(xiàn)在采用降低氧毒性的方法有采用高好氧的嗜熱鏈球菌來保護(hù)益生菌，采用添加半胱氨酸和抗壞血酸作為酸乳中的除氧劑，還有就是采用以聚苯乙烯為基礎(chǔ)物質(zhì)的阻氣材料作為發(fā)酵乳的包裝。但也有研究證明添加抗壞血酸對(duì)雙歧桿菌的數(shù)量影響不大。另外酸乳中添加抗壞血酸對(duì)酸乳質(zhì)地和營養(yǎng)性能上產(chǎn)生有害影響。

2.3 微囊化

微膠囊化是將活性細(xì)胞包裹于一種壁材中以保護(hù)其不受到周圍不利環(huán)境的影響的技術(shù)，例如對(duì)氧、胃酸、膽汁的隔離，保持菌活力的新技術(shù)有微膠囊化和雙層包埋方法，對(duì)益生菌進(jìn)行包埋，可提高食品中益生菌的穩(wěn)定性和存活能力；益生菌的雙層包埋技術(shù)是在益生菌表面包覆蛋白質(zhì)，再包一層特殊膠體，膠體在強(qiáng)酸性的胃酸中凝結(jié)，保護(hù)益生菌，膠體在益生菌進(jìn)入十二指腸時(shí)，自然分解溶化，釋放益生菌，而第二層的蛋白質(zhì)就會(huì)促進(jìn)益生菌與腸壁纖毛附著，同時(shí)提供益生菌繁殖所需要的營養(yǎng)[40]。Chandramouli V等[41]對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行了微膠囊化，認(rèn)為微膠囊方法可有效的保護(hù)乳酸菌對(duì)付不利的胃酸條件。Charalampopoulos D等[42，43]提出可采用谷物組分例如淀粉作為膠囊材料以改變他們的穩(wěn)定性和存活率，且指出谷物提取物對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用可能主要是糖的存在。Ding W K，Shah N P等[45]做了一系列微膠囊乳酸菌存活率的研究，指出藻酸鹽，黃原膠，卡拉膠等組成的微膠囊劑可明顯改善益生菌的存活率[44]，且改進(jìn)了一種乳酸菌微膠囊包埋的方法，使乳酸菌的存活率升高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。Brinques G B[46]對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行了研究，未包埋細(xì)胞和包埋細(xì)胞在模擬腸胃、冷藏環(huán)境和酸奶中的數(shù)量變化在模擬腸胃中沒有顯著的差異，且數(shù)量下降很多，在冷藏和酸奶中的變化，二者有差異，得出微囊化對(duì)益生菌在冷藏酸奶中的存活有一定的保護(hù)作用。

2.4 添加生長促進(jìn)因子

一些物質(zhì)會(huì)促進(jìn)益生菌的生長，例如低聚糖類，蛋白水解物，果蔬汁。

張曉蕾等[47]通過在產(chǎn)品中添加酪蛋白水解物來保持益生菌酸奶中的菌活性，選擇優(yōu)化的酪蛋白水解產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵牛奶中益生菌的生長及維持其生存能力均會(huì)產(chǎn)生積極地促進(jìn)作用；K.Kailasapathy[48]研究了一些水果制劑對(duì)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在保質(zhì)期中數(shù)量的影響，認(rèn)為在添加10 g水果制劑時(shí)，不同的水果對(duì)嗜酸乳桿菌數(shù)量有不同的效果，但不論是添加5 g還是10 g對(duì)雙歧桿菌的數(shù)量沒有顯著影響。

2.5 應(yīng)激適應(yīng)

應(yīng)激適應(yīng)就是利用誘導(dǎo)的方法，增強(qiáng)其對(duì)付不良環(huán)境的能力，使其很快產(chǎn)生適應(yīng)性細(xì)胞反應(yīng)。氧化應(yīng)激適應(yīng)通常是在溫度和發(fā)酵培養(yǎng)基都為微生物的最適狀態(tài)進(jìn)行。

3 結(jié)束語

高密度越來越重要，首先益生菌發(fā)酵食品和益生菌制劑需求隨著消費(fèi)者對(duì)健康食品的意識(shí)不斷加深而日益旺盛。而我國還沒有很成熟的乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)。另外工廠并不僅是把乳酸菌簡單的作為發(fā)酵劑，而是作為益生菌成分加入到產(chǎn)品，因?yàn)樯锪亢苤匾Ｋ崛橹圃焐檀_保在酸乳制備時(shí)加入足夠劑量的益生菌是必要的，因此無論是益生菌發(fā)酵食品、發(fā)酵劑或微生態(tài)制劑，實(shí)現(xiàn)益生菌體的高密度是首要條件，保持其活性的研究也同樣重要。

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Research on high cell density cultivation and survival of lactic acid bacteria in products

LI Qiu-qin1,WANG Shi-jie2,LU Chun2,YU Jing-hua1
(1.Department of food engineering and biotechnology,Tianjin university of S&T,Tianjin 300457,China;2.Shijiazhuang Junlebao dairy Co.Ltd,Shijiazhuang 050221,China)

High cell density cultivations(HCDC)of lactobacillus are very important as LAB not simply as starter but also as probiotics ingredient to add to beverage or other dairy product,and keeping the LAB survival by certain measures is also more important.This article focuses on the current knowledge of HCDC of LAB and some measures to keep the probiotics activity in the products.

Lactic acid bacteria;high cell density cultivation;probiotic activity

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）05-0021-05

2011-01-14

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（10117148A）；益生乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)技術(shù)的研究及產(chǎn)業(yè)化示范（BADC20091B02）。

李秋琴（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)。

于景華