孔雯雯，韓 磊，李 亮，邵長(zhǎng)倫，章 蓉，Nicole J.de Voogd ，王長(zhǎng)云＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，Netherlands）

一種中國(guó)南海海綿Xestospongia testudinaria中化學(xué)成分的研究＊

孔雯雯1，韓 磊1，李 亮1，邵長(zhǎng)倫1，章 蓉1，Nicole J.de Voogd2，王長(zhǎng)云1＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，Netherlands）

綜合運(yùn)用正相和反相硅膠柱層析、Sephadex LH－20凝膠柱層析以及制備HPLC等分離方法，從1種中國(guó)南海海綿Xestospongia testudinaria中追蹤分離抗腫瘤活性次級(jí)代謝產(chǎn)物。從95%乙醇提取物中分離獲得8個(gè)單體化合物，通過(guò)NMR，MS等波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯（1），E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯（2），麥角甾－5，7，22－三烯－3－醇（3），麥角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（4），膽甾－4－烯－3－酮（5），3－吲哚醛（6），3－吲哚酸（7）和5－吲哚醛（8）。其中，化合物2－5和8為首次從該屬海綿中分離得到?；衔?對(duì)腫瘤細(xì)胞株HCT116和A549顯示較強(qiáng)的抑制活性。

海綿；Xestospongia testudinaria；化學(xué)成分；分離；結(jié)構(gòu)鑒定

桶狀海綿Xestospongia testudinaria屬于尋常海綿綱（Demospongiae），單骨海綿目（Haplosclerida），Petrosiidae科，Xestospongia屬。文獻(xiàn)報(bào)道從該屬海綿中分離得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為鹵代脂肪酸，甾體，萜類(lèi)和生物堿等［1－5］。本研究在對(duì)中國(guó)南海海綿X.testudinaria的粗提物及各有機(jī)相進(jìn)行活性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯相具有細(xì)胞毒和鹵蟲(chóng)致死活性，進(jìn)而對(duì)該相進(jìn)行活性追蹤分離，并鑒定單體化合物的結(jié)構(gòu)，分別確定為：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯（1），E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯（2），麥角甾－5，7，22－三烯－3－醇（3），麥角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（4），膽甾－4－烯－3－酮（5），3－吲哚醛（6），3－吲哚酸（7）和5－吲哚醛（8）（見(jiàn)圖1）。對(duì)以上化合物的細(xì)胞毒和鹵蟲(chóng)致死活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)化合物1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和人肺腺癌細(xì)胞A549的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桶狀海綿X.testudinaria（Lamarck，1815）樣品于2006年4月采自中國(guó)南海臨高鄰昌礁海域，標(biāo)本保存于中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（HNLCJ－20060001），由荷蘭國(guó)家自然歷史博物館Nicole J.de Voogd博士鑒定（RMNH POR.5230）。

Micromass Q－TOF質(zhì)譜儀；JEOL JEM－ECP600核磁共振波譜儀；Bruker DRX－400核磁共振波譜儀；高效液相色譜儀（Waters公司）（1525泵，2996二極管陣列檢測(cè)器，717自動(dòng)進(jìn)樣器）；色譜柱：Kromasil C18，7μm，10×250 mm；Sephadex LH－20為Pharmacia公司產(chǎn)品；柱層析硅膠（200－300目）和薄層層析硅膠（GF254）為青島海洋化工廠(chǎng)產(chǎn)品。

1.2 提取與分離

新鮮海綿樣品（干質(zhì)量680 g），切碎后于室溫下用95%乙醇超聲浸提4次（4×1 000 m L），過(guò)濾，合并提取液，將浸膏分散于400 m L水中，依次用等體積的乙酸乙酯和正丁醇分別萃取6次，各萃取液減壓濃縮后，得乙酸乙酯相浸膏（9.7 g）和正丁醇相浸膏（6.5 g）。

乙酸乙酯相顯示一定的細(xì)胞毒和鹵蟲(chóng)致死活性，在100μg／mL時(shí)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549抑制率為45%，對(duì)鹵蟲(chóng)的致死率為40%。乙酸乙酯相浸膏經(jīng)硅膠柱層析，石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫，分為8個(gè)組分（Fr.1～8）。Fr.2組分對(duì)A549的抑制率在100μg／m L時(shí)為65%。Fr.4和Fr.7組分在100μg／m L時(shí)致死率分別為25%和40%。經(jīng)反復(fù)的硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備HPLC的分離純化，從Fr.2組分獲得化合物1（9.6 mg），2（7.8 mg）和5（10.0 mg），從Fr.4組分中得到化合物3（500.0 mg）和4（50.0 mg），從Fr.7組分中分離得到化合物6（7.4 mg），7（11.2 mg）和8（4.1 mg）。

1.3 生物活性測(cè)定

細(xì)胞毒活性選用人肺腺癌細(xì)胞A549，人白血病細(xì)胞HL60和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，采用MTT法測(cè)定［6］。鹵蟲(chóng)致死活性采用鹵蟲(chóng)Artemia salina，按照Solis改良法［7－9］測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)活性追蹤分離的方法，從桶狀海綿X.testudinaria提取物的乙酸乙酯相中分離鑒定了8個(gè)化合物（見(jiàn)圖1），包括2個(gè)含溴多烯炔化合物，3個(gè)甾體化合物和3個(gè)吲哚衍生物。

圖1 化合物1－8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1－8

化合物1 無(wú)色油狀物。ESI－MS在m／z 443與465處分別給出［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰與［M＋Na］＋峰，同時(shí)在m／z445和447，以及467和469處給出與分子離子峰等高的同位素峰，提示該化合物含有兩個(gè)溴原子。結(jié)合其1HNMR譜，13CNMR和DEPT譜確定分子式為C19H24Br2O2，具有7個(gè)不飽和度。1HNMR譜低場(chǎng)區(qū)給出2個(gè)相互偶合的烯氫信號(hào)δ6.37（1H，dt，J＝16.0，7.1 Hz），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz）及1個(gè)孤立的烯氫信號(hào)δ6.27（1H，t，J＝7.1 Hz），結(jié)合13CNMR和DEPT譜信息，確定該分子中有2個(gè)雙鍵的存在。而13CNMR譜低場(chǎng)區(qū)給出1個(gè)酯羰基信號(hào)δ175.0。由此判斷該化合物中成環(huán)或含有其他類(lèi)型的不飽和鍵才能符合7個(gè)不飽和度。在氧原子數(shù)目已定的前提下，13CNMR譜δ89.0，82.3，74.5和66.9被確定為4個(gè)炔碳信號(hào)，為分子式貢獻(xiàn)了剩余的4個(gè)不飽和度。另外，1HNMR譜高場(chǎng)區(qū)δ2.48（2H，t，J＝7.4 Hz），2.37（2H，dt，J＝6.9，1.0 Hz），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz）和2.12（2 H，dq，J＝7.1 Hz）處分別為與酯羰基和不飽和鍵相連的亞甲基氫信號(hào)，δ3.67（3H，s）提示分子有甲氧基的存在。綜合以上

波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)［5］對(duì)照，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.37（1 H，dt，J＝16.0，7.1 Hz，H－10），6.27（1 H，t，J＝7.1 Hz，H－17），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz，H－9），3.67（3H，s，H－OCH3），2.48（2H，t，J＝7.4 Hz，H－2），2.37（2 H，dt，J＝6.9，1.0 Hz，H－4），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz，H－16），2.12（2H，dq，J＝7.1，1.5，Hz，H－11）；13CNMR（100 MHz，CDCl3，TMS，δ）：175.0（C，C－1），148.0（CH，C－10），139.1（CH，C－17），109.0（CH，C－9），89.0（C，C－5），82.3（C，C－6），74.5（C，C－7），66.9（C，C－8），51.6（CH3，COMe），32.9（CH2，C－2），32.8（CH2，C－11），32.2（CH2，C－16），28.5（CH2，C－12），28.5（CH2，C－13），28.2（CH2，C－14），27.4（CH2，C－15），23.4（CH2，C－3），18.6（CH2，C－4）；ESI－MS m／z：447／445／443［M＋H］＋469／467／465［M＋Na］＋。

化合物2 無(wú)色油狀物。與化合物1的1HNMR譜對(duì)比，顯示2個(gè)化合物結(jié)構(gòu)極為相似，不同之處在于化合物2少了δ3.67處的甲基信號(hào)峰，而在δ4.17和1.21處分別多了2個(gè)氫信號(hào)和1個(gè)甲基信號(hào)。結(jié)合質(zhì)譜ESI－MS給出的m／z 483／481／479［M＋Na］＋峰，確定化合物2與化合物1的差別在于乙氧基取代了甲氧基連接于酯羰基處。綜合以上信息，并與文獻(xiàn)［5］對(duì)照，確定化合物2的結(jié)構(gòu)為：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.37（1 H，dt，J＝16.0，7.1 Hz，H－10），6.27（1H，t，J＝7.1 Hz，H－17），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz，H－9），4.17（2 H，q，J＝7.6 Hz，HOEt），2.48（2 H，t，J＝7.4 Hz，H－2），2.37（2 H，dt，J＝6.9，1.0 Hz，H－4），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz，H－16），2.12（2H，dq，J＝7.1，1.5，Hz，H－11），1.21（3 H，t，J＝7.6 Hz，H－OEt）；ESI－MS m／z：483／481／479［M＋Na］＋。

化合物3 白色粉末?；衔?HNMR譜高場(chǎng)區(qū)δ1.0～2.2處給出甾體特征的亞甲基信號(hào)峰，以及兩個(gè)角甲基信號(hào)δ0.63（3H，s）和0.94（3H，s），甾體支鏈上4個(gè)裂分為d峰的特征甲基信號(hào)δ0.82（3 H，d，J＝6.5 Hz），0.85（3 H，d，J＝6.5 Hz），0.92（3 H，d，J＝6.5 Hz）和1.03（3H，d，J＝6.5 Hz）?；瘜W(xué)位移δ3.63（1H，m）處為甾醇C－3位連氧碳上的氫信號(hào)。低場(chǎng)區(qū)δ5.57（1 H，d，J＝5.5 Hz），5.34（1 H，d，J＝5.5 Hz）為一對(duì)順式偶合的雙鍵氫信號(hào)。δ5.23（1 H，dd，J＝15.1，7.3 Hz）和5.16（1 H，dd，J＝15.1，7.8 Hz）為一對(duì)反式偶合的雙鍵氫信號(hào)。以上分析結(jié)合文獻(xiàn)［10］，確定化合物3為麥角甾－5，7，22－三烯－3－醇，核磁數(shù)據(jù)：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：5.57（1H，d，J＝5.5，H－6），5.34（1 H，d，J＝5.5 Hz，H－7），5.23（1H，dd，J＝15.1，7.3 Hz，H－23），5.16（1H，dd，J＝15.1，7.8 Hz，H－22），3.63（1H，m，H－3），1.03（3H，d，J＝6.5 Hz，H－21），0.94（3 H，s，H－19），0.92（3H，d，J＝6.5 Hz，H－28），0.85（3H，d，J＝6.5 Hz，H－27），0.82（3H，d，J＝6.5 Hz，H－26），0.63（3H，s，H－18）。

化合物4 無(wú)色片狀晶體。1HNMR譜也顯示出甾體化合物的波譜特征信號(hào)，包括2個(gè)角甲基信號(hào)δ1.02（3H，s），1.01（3H，s），和甾體支鏈上4個(gè)裂分為d峰的特征甲基信號(hào)δ1.09（3H，d，J＝6.7 Hz），0.95（3H，d，J＝6.8 Hz），0.87（3H，d，J＝6.8 Hz），0.85（3H，d，J＝6.8 Hz）。另外1HNMR譜低場(chǎng)區(qū)給出2個(gè)順式偶合的雙鍵氫信號(hào)δ6.66（1H，d，J＝9.5 Hz）和6.10（1H，d，J＝9.5 Hz），2個(gè)反式偶合的雙鍵氫信號(hào)δ5.32（1 H，dd，J＝15.2，7.3 Hz）和5.27（1H，dd，J＝15.2，7.9 Hz）以及1個(gè)孤立的烯氫信號(hào)δ5.65（1 H，s）。結(jié)合13CNMR和DEPT譜數(shù)據(jù)分析，化合物5可能為含有4個(gè)雙鍵的不飽和甾體。

結(jié)合ESI－MS的分析，m／z 393處的［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰確定了該化合物的分子式為C28H40O。13CNMR譜信號(hào)δ197.3提示分子中含有酮羰基，而季碳δ163.3可能與羰基碳處于同一共軛體系導(dǎo)致其向低場(chǎng)位移，即該化合物具有不飽和酮的結(jié)構(gòu)片段。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道數(shù)據(jù)一致，確定化合物4為麥角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.66（1H，d，J＝9.5 Hz，H－7），6.10（1H，d，J＝9.5 Hz，H－6），5.65（1H，s，H－4），5.32（1H，dd，J＝15.2，7.3 Hz，H－23），5.27（1 H，dd，J＝15.2，7.9 Hz，H－22），1.09（3 H，d，J＝6.7 Hz，H－21），1.02（3H，s，H－19），1.01（3 H，s，H－18），0.95（3 H，d，J＝6.8 Hz，H－28），0.87（3H，d，J＝6.8 Hz，H－27），0.85（3H，d，J＝6.8 Hz，H－26）；13CNMR（150 MHz，CDCl3，TMS，δ）：197.3（C，C－3），163.3（C，C－5），155.3（C，C－14），135.4（CH，C－22），133.4（CH，C－7），132.3（CH，C－23），124.6（C，C－8），124.6（CH，C－6），122.9（CH，C－4），55.8（CH，C－17），44.6（CH，C－9），43.9（C，C－13），43.0（CH，C－24），39.4（CH，C－20），36.7（C，C－10），35.8（CH2，C－12），34.1（CH2，C－1），33.9（CH2，C－2），33.1（CH，C－25），27.7（CH2，C－16），25.0（CH2，C－15），20.9（CH3，C－21），19.6（CH3，C－27），19.2（CH3，C－26），18.9（CH2，C－11），18.5（CH3，C－18），17.3（CH3，C－28），16.1（CH3，C－19）；ESI－MS m／z：［M＋H］＋393。

化合物5 無(wú)色油狀物。ESI－MS m／z 407［M＋Na］＋給出相對(duì)分子量為384，1HNMR在高場(chǎng)區(qū)δ1.00～2.10處給出甾體骨架的多個(gè)亞甲基信號(hào)，且δ1.17（3 H，s）和0.70（3 H，s）處的2個(gè)甲基為甾體特征的C－18，C－19位角甲基信號(hào)，δ0.96（6 H，d，J＝6.5 Hz），0.93（3H，d，J＝6.5 Hz）亦為甾體支鏈上特征的甲基信號(hào)，另外1HNMR譜在低場(chǎng)區(qū)還給出1個(gè)烯氫信號(hào)δ5.72（1 H，s）。綜合以上分析，并與文獻(xiàn)［12］對(duì)照，確定化合物5為膽甾－4－烯－3－酮。核磁數(shù)據(jù)：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：5.72（1H，s，H－4），1.17（3H，s，H－19），0.96（6H，d，J＝7.0 Hz，H－26，27），0.93（3H，d，J＝6.5 Hz，H－21），0.70（3 H，s，H－18）；ESI－MS m／z：407［M＋Na］＋。

化合物6 白色粉末。1HNMR譜給出了4個(gè)芳香環(huán)上的烯氫信號(hào)δ8.15（1H，brd，J＝7.0 Hz），7.46（1 H，brd，J＝7.5 Hz）和7.25（2 H，m），提示分子中可能存在鄰位雙取代的苯環(huán)。另外還給出1個(gè)醛基氫信號(hào)δ9.87（1 H，s）。而ESI－MS給出的144［M－H］－準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)氮規(guī)則推測(cè)化合物中存在氮原子。由此推斷該化合物可能為芳香生物堿類(lèi)化合物。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道數(shù)據(jù)一致，確定化合物6為3－吲哚醛。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（400 MHz，CD3OD，TMS，δ）：9.87（1 H，s，H－10），8.15（1 H，brd，J＝7.0 Hz，H－4），8.09（1H，s，H－2），7.46（1H，brd，J＝7.5 Hz，H－7），7.25（2 H，m，H－5，6）；ESI－MS m／z：144［M－H］－。

化合物7 白色粉末。與化合物6的1HNMR譜進(jìn)行比較，化合物7少了δ9.87處的醛基氫，結(jié)合ESI－MS譜圖給出的m／z 160［M－H］－準(zhǔn)分子離子峰，參照文獻(xiàn)［14］，確定該化合物為3－吲哚酸。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（400 MHz，CD3OD，TMS，δ）：8.08（1 H，m，H－7），7.87（1H，s，H－2），7.42（1H，m，H－4），7.17（2 H，m，H－5，6）；ESI－MS m／z：160［M－H］－?；衔? 淡黃色油狀物。ESI－MS給出準(zhǔn)分子離子峰m／z 144［M－H］－，提示該化合物與化合物6具有相同的分子式，故與化合物6的1HNMR進(jìn)行比較，δ10.08（1H，s）表明醛基仍存在，但其位置發(fā)生了改變。通過(guò)計(jì)算偶合常數(shù)，發(fā)現(xiàn)化合物8的苯環(huán)區(qū)只有3個(gè)芳香氫信號(hào)δ8.32（1 H，dd，J＝7.0，2.4 Hz），7.85（1 H，t，J＝2.4 Hz），7.44（1H，d，J＝7.1 Hz），由此推斷醛基取代了苯環(huán)上5位或6位的芳香氫。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，確定化合物8為5－吲哚醛。波譜數(shù)據(jù)：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：10.08（1H，s，H－10），8.32（1H，dd，J＝7.1，2.4，H－6），7.85（1H，t，J＝2.4，H－4），7.44（1 H，d，J＝7.1，H－7），7.36（1H，m，H－2），7.30（1H，m，H－3）；ESI－MS m／z：144［M－H］－。2.2生物活性測(cè)定

鹵蟲(chóng)致死活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，化合物1－8對(duì)鹵蟲(chóng)A.salina顯示弱的或無(wú)致死活性。細(xì)胞毒活性測(cè)試顯示，化合物1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和人肺腺癌細(xì)胞A549的增殖具有抑制作用，IC50分別為8.1和6.3 μg／m L。

本研究采用活性追蹤分離的方法，從中國(guó)南海桶狀海綿X.testudinaria中分離鑒定了8個(gè)化合物。其中，化合物2－5和8為首次從該屬海綿中分離得到。結(jié)合文獻(xiàn)［3］推測(cè)，2個(gè)含溴的多烯炔化合物1和2為該屬海綿中特征性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。化合物1顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，為該海綿樣品的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物及藥物發(fā)現(xiàn)研究提供了基礎(chǔ)資料。

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Chemical Constituents of Sponge Xestospongia testudinaria from the South China Sea

KONG Wen－Wen1，HAN Lei1，LI Liang1，SHAO Chang－Lun1，ZHANG Rong1，Nicole J.de Voogd2，WANG Chang－Yun1
（1.The Key Laboratory of Marine Drugs，Ministry of Education，School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，the Netherlands）

The chemical constituents of sponge Xestospongia testudinaria from the South China Sea were investigated by bioassay－guided fractionation.Eight compounds were isolated from 95%ethanolic extract by repeated column chromatography on silica gel and Sephadex LH－20，and preparative－HPLC.By means of spectroscopic data including NMR and MS，their structures were elucidated as E－9，17－octadecadiene－5，7－diynoic acid－18，18－dibromo－methyl ester（1），E－9，17－octadecadiene－5，7－diynoic acid－18，18－dibromoethyl ester（2），ergosta－5，7，22－trien－3－ol（3），ergosta－4，6，8（14），22－tetraen－3－one（4），cholest－4－en－3－one（5），1 H－indole－3－carboxaldehyde（6），1 H－indole－3－carboxylic acid（7）and 1 H－indole－5－carboxaldehyde（8）.Compounds 2－5 and 8 were reported from genus Xestospongia for the first time.Moreover，compound 1 showed potent cytotoxicity towards tumor cell lines HCT116 and A549.

sponge；Xestospongia testudinaria；chemical constituents；isolation；structure elucidation

Q959.120.6

A

1672－5174（2011）11－086－05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（40776073；30901879）；國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)（2007FY210500）；國(guó)家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（20090132110002）資助

2011－01－15；

2011－09－02

孔雯雯（1987－），女，碩士生。E－mail：enga87＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：changyun＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 徐 環(huán)