于瑞海，王昭萍，趙雪琳，孔 靜，張志強(qiáng)，許瑞平，范立強(qiáng)

（1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003；2.山東海益寶水產(chǎn)有限公司，山東煙臺(tái)265100）

蝦夷扇貝雌雄同體自體受精繁殖生物學(xué)的研究＊

于瑞海1，王昭萍1，趙雪琳1，孔 靜1，張志強(qiáng)1，許瑞平1，范立強(qiáng)2

（1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003；2.山東海益寶水產(chǎn)有限公司，山東煙臺(tái)265100）

本文以蝦夷扇貝的雌雄同體個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)成熟個(gè)體的性腺進(jìn)行組織切片觀察，并通過對(duì)雌雄同體自體受精、早期胚胎發(fā)育和幼蟲培養(yǎng)的研究，發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝自體繁殖的產(chǎn)卵量、受精率和卵裂率與對(duì)照組沒有很大差異，但是其孵化率和畸形率有明顯差異分別為82%和17.3%，而對(duì)照組為90%和9.6%；幼蟲培育期間的生長(zhǎng)沒有明顯差異，但成活率差異極明顯為4%，而對(duì)照組為40%。

蝦夷扇貝；雌雄同體；自體受精；胚胎發(fā)育；幼體培育

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）原產(chǎn)于日本和朝鮮，現(xiàn)已引進(jìn)我國，因個(gè)體大，閉殼肌肥大，味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，生長(zhǎng)快，經(jīng)濟(jì)效益好，深受廣大消費(fèi)者和養(yǎng)殖單位歡迎，現(xiàn)已在山東、遼寧等北方沿海進(jìn)行大面積的人工養(yǎng)殖和底播增殖生產(chǎn)［1－2］。近幾年蝦夷扇貝養(yǎng)殖出現(xiàn)的大量死亡問題，給養(yǎng)殖企業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，一定程度上與種質(zhì)的退化有關(guān)［3］。

近年來，在進(jìn)行蝦夷扇貝人工育苗的過程中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖的成貝中存在著大量雌雄同體的個(gè)體，經(jīng)粗略統(tǒng)計(jì)，2006年5%～6%，而2007年為8%～9%，2008—2009年在10%以上，最高可達(dá)18%。針對(duì)這一現(xiàn)象，作者在2010年春季進(jìn)行了利用蝦夷扇貝的雌雄同體個(gè)體開展繁殖生物學(xué)研究，探討其能否進(jìn)行自體受精發(fā)育、自交后代能否正常生長(zhǎng)，為研究蝦夷扇貝死亡原因以及選種和雜交育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 親貝于2010年1月從大連購進(jìn)，在煙臺(tái)海益寶水產(chǎn)有限公司親貝培育車間暫養(yǎng)1個(gè)月。性腺肥滿度達(dá)25%以上時(shí)即可進(jìn)行產(chǎn)卵。在親貝暫養(yǎng)池選取雌雄同體的蝦夷扇貝3只，殼高12 cm以上，性腺飽滿度好，外型規(guī)則，活力好，其中1只進(jìn)行組織切片觀察。再選取性腺飽滿度好的正常的雌雄異體的雌貝2只，性腺發(fā)育好的雄貝2只。

1.1.2 育苗器材 50 L的白色塑料桶6個(gè)，換水濾鼓、育苗器材等，管理按蝦夷扇貝的人工育苗正常操作進(jìn)行。

1.1.3 性腺組織切片 進(jìn)行性腺組織切片所需要的藥品、切片機(jī)、顯微照相等儀器。

1.2 方法

1.2.1 蝦夷扇貝雌雄同體性腺組織切片 對(duì)取得蝦夷扇貝雌雄同體進(jìn)行解剖、觀察，并將切取的一部分性腺組織用波恩（Bouin）氏液固定，石蠟包埋切片（切片厚度5μm），蘇木精－伊紅（H－E）染色。顯微鏡下觀察蝦夷扇貝雌雄同體性腺結(jié)構(gòu)狀況。顯微鏡觀察（Olympus BX50，日本）、拍照（Olympus DP70，日本）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 繁殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 2個(gè)雌雄同體個(gè)體分別編號(hào)A、B；2個(gè)雌貝編號(hào)C、D；2個(gè)雄貝則編號(hào)為E、F。從受精率、卵裂率、孵化率等繁殖生物學(xué)指標(biāo)對(duì)比分析。

1.2.2.2 幼蟲培育實(shí)驗(yàn) 主要設(shè)計(jì)雌雄同體蝦夷扇貝組，取平行的3組，編號(hào)為1、2、3，其中1是A個(gè)體、2是B個(gè)體，3是從1和2中取出等體積的受精卵混合在一起。雌雄異體蝦夷扇貝（蝦夷♀×蝦夷♂）的對(duì)比編號(hào)為4、5、6，幼蟲生長(zhǎng)速度、成活率、附著變態(tài)率等各方面的生長(zhǎng)性狀來進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.3 親貝的產(chǎn)卵與受精 把A、B、C、D、E、F編號(hào)的種貝進(jìn)行陰干處理1 h后，分別放入相應(yīng)編號(hào)的50 L的白色塑料桶內(nèi)在桶中，加入13℃的過濾海水，微量充氣進(jìn)行產(chǎn)卵、排精。按預(yù)先設(shè)計(jì)方案，及時(shí)完成對(duì)各實(shí)驗(yàn)組人工授精，對(duì)于精子過多的實(shí)驗(yàn)組，要進(jìn)行洗卵，顯微鏡檢每個(gè)卵子周圍有4～5個(gè)精子為宜。

1.2.4 蝦夷扇貝雌雄同體組的胚胎發(fā)育觀察 蝦夷扇貝的受精卵屬沉性卵，需經(jīng)常進(jìn)行攪動(dòng)，其胚胎發(fā)育的水溫是13℃。在孵化期間每隔20 min進(jìn)行1次顯微鏡觀察，記錄胚胎發(fā)育情況。

1.2.5 幼蟲培育階段的管理

1.2.5.1 選優(yōu) 發(fā)育到D形幼蟲時(shí)，用300目網(wǎng)箱及時(shí)選出。幼蟲培育密度為5～6個(gè)／m L，幼蟲培育編號(hào)

1、2、3 為雌雄同體組，4、5、6為正常的對(duì)照組。

1.2.5.2 幼蟲管理

（1）投餌

剛孵化出來的幼蟲開口餌料為金藻，中、后期后又增加扁藻等，投餌量應(yīng)根據(jù)幼蟲攝食情況確定，每天投餌4次。

（2）換水與充氣

每日換水2次。每次換水量1／3～1／2。不間斷微量充氣。

（3）測(cè)量和觀察

每天顯微鏡觀察幼蟲的生長(zhǎng)情況，測(cè)量幼蟲的大小和成活率記錄，以確定其生長(zhǎng)速度和成活率。

1.2.6 各種參數(shù)的計(jì)算

受精率＝［受精卵（已排第一極體）÷總卵數(shù)］×100%

卵裂率＝［已分裂的受精卵÷（受精卵）］×100%

D形幼蟲孵化率＝［D形幼蟲÷（受精卵）］×100%

幼蟲成活率＝幼蟲成活的最后密度÷原始的密度×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝雌雄同體性腺組織切片觀察

通過石蠟包埋組織切片觀察，其性腺結(jié)構(gòu)見圖1 a、b、c所示。

圖1 蝦夷扇貝雌雄同體個(gè)體和對(duì)照組性腺切片比較Fig.1 Slice images of germen of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

2.2 蝦夷扇貝雌雄同體胚胎發(fā)育時(shí)序

從受精卵胚胎發(fā)育階段開始定時(shí)進(jìn)行記錄，并與正常的蝦夷扇貝受精卵發(fā)育進(jìn)行對(duì)比分析。以授精時(shí)間為起始時(shí)刻，記錄胚胎發(fā)育時(shí)間（min），具體見表1。

表1 雌雄同體自交個(gè)體和雌雄異體發(fā)育后代的比較Table 1 Comparison of offspring of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the dioecism／min

通過觀察，雌雄同體蝦夷扇貝自體受精的胚胎發(fā)育比雌雄異體受精在2細(xì)胞期發(fā)育快，在4細(xì)胞期以后胚胎發(fā)育稍慢些，約0.5 h，但總體上來看，二者差別不大，可認(rèn)為胚胎發(fā)育是同步的。

2.3 蝦夷扇貝雌雄同體與對(duì)照組在產(chǎn)卵量、受精率、卵裂率、孵化率、畸形率上的比較

經(jīng)連續(xù)的測(cè)量和計(jì)數(shù)，蝦夷扇貝雌雄同體與對(duì)照組在產(chǎn)卵量、受精率、卵裂率、孵化率、畸形率上的比較結(jié)果見表2。

表2 蝦夷扇貝雌雄同體受精發(fā)育情況變化比較Table 2 Comparison of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

由于實(shí)驗(yàn)所用蝦夷扇貝已經(jīng)產(chǎn)過1次卵，所以產(chǎn)卵時(shí)產(chǎn)卵量不是太大，正常應(yīng)在1 000萬粒以上，通過以上數(shù)據(jù)的方差分析，得出P＞0.05，可知道雌雄同體蝦夷扇貝自交組與對(duì)照組二者沒有區(qū)別。但在孵化率和畸形率方面蝦夷扇貝雌雄同體自交組和對(duì)照組相比有比較大的差異。

2.4 蝦夷扇貝雌雄同體實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組生長(zhǎng)發(fā)育情況比較

2.4.1 蝦夷扇貝雌雄同體幼蟲生長(zhǎng)比較 把剛選優(yōu)出的幼蟲，在相同培育條件下，蝦夷扇貝雌雄同體實(shí)驗(yàn)組和正常的蝦夷扇貝雌雄異體對(duì)照組幼蟲，每2 d測(cè)量1次，每次測(cè)量10個(gè)幼體，實(shí)驗(yàn)有2組平行組，求出其平均大小，并根據(jù)其生長(zhǎng)成活情況，經(jīng)常調(diào)整其密度，保持其幼蟲培育密度一致，殼長(zhǎng)生長(zhǎng)情況見圖2。

圖2 蝦夷扇貝雌雄同體自交幼蟲組和對(duì)照組生長(zhǎng)比較Fig.2 Comparison of shell height of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's at larvae stage

從圖上可看出，二者在生長(zhǎng)發(fā)育速度上沒有差別，而且幼蟲生長(zhǎng)情況、攝食情況跟正常的對(duì)照組幼蟲沒有差異。

2.4.2 蝦夷扇貝雌雄同體幼蟲成活率比較 把剛選優(yōu)出的幼蟲，在相同培育條件下，蝦夷扇貝雌雄同體實(shí)驗(yàn)組和正常的蝦夷扇貝雌雄異體對(duì)照組幼蟲，每2 d測(cè)量1次密度，實(shí)驗(yàn)有2組平行組，求出其平均密度，并根據(jù)其生長(zhǎng)成活情況，經(jīng)常調(diào)整其密度，保持其幼蟲培育密度一致，至投附著基期間成活變化情況見圖3，其最終的成活率見圖4。

從圖3和圖4可以看出，蝦夷扇貝雌雄同體實(shí)驗(yàn)組的幼蟲與對(duì)照組二者在存活率方面，差異明顯，雌雄同體自交組成活率僅為4%，而對(duì)照組是40%。實(shí)驗(yàn)組幼蟲培育至160μm幼蟲成活率降幅最大，死亡率在90%以上，160μm以后基本上穩(wěn)定。

圖3 蝦夷扇貝雌雄同體自交幼蟲組和對(duì)照組存活情況比較Fig.3 Comparison of the change of the survival rate of selffertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's at larvae stage

圖4 蝦夷扇貝雌雄同體自交幼蟲組和對(duì)照組成活率比較Fig.4 Comparison of survival rates of the larvae of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

3 討論

3.1 蝦夷扇貝雌雄同體性腺組織結(jié)構(gòu)類型

通過組織切片觀察蝦夷扇貝雌雄同體的性腺組織，在所觀察的個(gè)體中存在2種結(jié)構(gòu)，一種是卵細(xì)胞和精細(xì)胞在同一濾泡中，另一種是卵細(xì)胞和精細(xì)胞分屬2個(gè)濾泡中，但都屬于在性腺組織腹嵴的上，可以通過外觀顏色觀察到，這與王梅芳［4］在2種江珧中發(fā)現(xiàn)的雌雄同體的2種情況相似，但與王梅芳［5］在馬氏珠母貝中發(fā)現(xiàn)的雌雄同體中存在的2種情況不同，這可能是與品種不同造成，也可能與解剖觀察的數(shù)量不足有關(guān)。

3.2 蝦夷扇貝雌雄同體自體受精發(fā)育與正常受精發(fā)育上的差異分析

蝦夷扇貝雌雄同體自體受精發(fā)育和正常的個(gè)體受精發(fā)育相比雖然可以進(jìn)行，并且在受精率、卵裂率、孵化率等方面沒有顯著差異，但是在畸形率方面存在較大差異，明顯低于正常對(duì)照組。而在幼體生長(zhǎng)發(fā)育方面生長(zhǎng)速度差異不明顯，但在幼蟲成活率方面差異明顯，明顯低于的對(duì)照組，這種差異也許是由于雌雄同體親本的配子自交導(dǎo)致近親繁殖，造成幼蟲體質(zhì)差，成活率降低的原因之一，具體造成雌雄同體比例增多的原因是否與種質(zhì)退化有關(guān)還是與環(huán)境有關(guān)有待于進(jìn)步一研究。

3.3 蝦夷扇貝雌雄同體自體受精繁殖的生物學(xué)意義

蝦夷扇貝雌雄同體自體受精后代雖然在成活率方面較低，但在生長(zhǎng)上和對(duì)照組沒有明顯區(qū)別，并能正常發(fā)育、附著變態(tài)，培育至幼苗，這為蝦夷扇貝的選擇和雜交育種打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。從理論上講，同一個(gè)體精、卵結(jié)合，其后代中基因純化速率最快，自體受精是近親繁殖中親緣關(guān)系最近的交配方式，因此，用自體受精的方法來產(chǎn)生高純度的個(gè)體比用其他近交方法要快的多［6－7］。目前張國范、鄭懷平和張海濱等［8－11］利用雌雄同體的海灣扇貝已進(jìn)行了自交家系的建立和生長(zhǎng)等方面的研究，顯示出該途徑對(duì)海灣扇貝有較大的育種價(jià)值。劉曉也開展了利用雌雄同體的蝦夷扇貝自體受精建立自交系的研究，見中國專利（劉曉等，一種雌雄異體型貝類自交系的建立方法，國家發(fā)明專利，授權(quán)時(shí)間：2006，專利號(hào)：ZL200410050568.0）［13］。

目前，我國進(jìn)行養(yǎng)殖的扇貝基本上都是沒有經(jīng)過系統(tǒng)的人工選育，其遺傳基礎(chǔ)是野生型的，生長(zhǎng)速度，抗逆能力乃至品質(zhì)質(zhì)量［12］，都需要經(jīng)過系統(tǒng)的人工選育而加以改進(jìn)，進(jìn)行這方面的探索對(duì)于保證扇貝養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，進(jìn)行扇貝的遺傳育種改良，增加貝類的遺傳多樣性，以期對(duì)扇貝的遺傳育種工作提供一定的理論基礎(chǔ)。根據(jù)優(yōu)良品種選育理論，要使優(yōu)良性狀的基因純化，從而將性狀穩(wěn)定地遺傳給后代，是幾乎所有優(yōu)良品種培育必經(jīng)的過程。而這個(gè)過程通常是采用具有親緣關(guān)系的親本多代近交的方法來實(shí)現(xiàn)［6，14］。由于貝類易受壽命短、性成熟年齡、每年的繁殖季節(jié)等限制，良種培育往往要經(jīng)過五代以上的選育才能獲得。因此，如何使初選親本的種質(zhì)純化并穩(wěn)定下來是非常關(guān)鍵的工作，可以利用蝦夷扇貝雌雄同體自體受精繁殖后代的基因純合度高，易于快速選育高純合度品系的特點(diǎn)，選擇優(yōu)良個(gè)體進(jìn)行了連續(xù)自交培育，以其培育出性狀優(yōu)良蝦夷扇貝新品種，促進(jìn)蝦夷扇貝增養(yǎng)殖業(yè)健康穩(wěn)定的可持續(xù)發(fā)展。雖然蝦夷扇貝雌雄同體自體受精后代成活率較低，但由于蝦夷扇貝產(chǎn)卵量較大，其成活的數(shù)量可以滿足生產(chǎn)上選種的需要，從而為蝦夷扇貝的選擇和雜交育種提供很好的實(shí)驗(yàn)材料。

［1］ 張福綏，何義朝，馬江虎，等.蝦夷扇貝的引種、育苗及試養(yǎng)［J］.海洋科學(xué)，1984，1（5）：38－45.

［2］ 王慶成.蝦夷扇貝的引進(jìn)及其在我國北方增養(yǎng)殖的前景［J］.水產(chǎn)科學(xué)，1984，3（4）：24－27.

［3］ 張明明，趙文.我國蝦夷扇貝死亡原因的探討及控制對(duì)策［J］.中國水產(chǎn)，2008（2）：65－66，74.

［4］ 王梅芳，余祥勇，王君彥.兩種江珧雌雄同體及性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象［J］.湛江海洋大學(xué)報(bào)，1999，19（4）：6－11.

［5］ 王梅芳，余祥勇，劉永，等.馬氏珠母貝雌雄同體和自體受精的研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2006，30（4）：420－424.

［6］ 劉少軍，姚占州，劉筠.能自體受精的雌雄同體黃邊胡鲇的性腺結(jié)構(gòu)研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，1995，19（1）：92－93.

［7］ 劉少軍，王躍群，姚占州.人工誘導(dǎo)雌雄同體革胡子鲇自體受精后代的胚胎發(fā)育的研究［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，1997，4（2）：7－12.

［8］ 張國范，劉述錫，劉曉，等.海灣扇貝自交家系的建立和自交效應(yīng)［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2003，10（6）：441－445.

［9］ 鄭懷平，張國范，劉曉，等.海灣扇貝雜交家系與自交家系生長(zhǎng)和存活的比較［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2004，28（3）：267－272.

［10］ 鄭懷平，張國范，劉曉，等.不同貝殼顏色海灣扇貝（Argopecten irradians）家系的建立及生長(zhǎng)發(fā)育研究［J］.海洋與湖沼，2003，34（6）：632－639.

［11］ 張海濱，劉曉，張國范，等.不同有效繁殖群體數(shù)對(duì)海灣扇貝F1生長(zhǎng)和存活的影響［J］.海洋學(xué)報(bào)，2005，27（2）：177－180.

［12］ 潘瑛，李琪，王如才，等.海洋貝類雌核發(fā)育研究進(jìn)展和展望［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2002，26（5）：465－471.

［13］ 劉曉，張國范.一種雌雄異體型貝類自交系的建立方法［P］.國家發(fā)明專利，2006，ZL200410050568.0）.

［14］ 范兆廷.水產(chǎn)動(dòng)物育種學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：241－242.

Reproductive Biology of Self Fertilization in Hermaphrodite Japanese Scallops（Patinopecten yessoensis）

YU Rui－Hai1，WANG Zhao－Ping1，ZHAO Xue－Lin1，KONG Jing1，ZHANG Zhi－Qiang1，XU Rui－Ping1，F(xiàn)AN Li－Qiang2
（1.College of Fisheries，Ocean University of China，Qindao 266003，China；2.Shangdong Haiyibao Aquatic Products Co.，LTD，Yantai 265100，China）

On basis of observation on gonad samples from embryo and larvae obtained by self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis，the results showed that the difference in ova number，rate of fertilization and cleavage rate of self－fertilization of hermaphrodite was not significant compared with the dioecism.But the difference in hatching and abnormality rate was significant between them.The hatching and abnormality rate of larvae were obtained by self－fertilization were 82%and 17.3%，and the control group's were 90%and 9.6%.The growth of the larvae obtained by self－fertilization was almost the same as the control group's.But the difference in survival rate was significant between them，the survival rate was 4%and 40%respectively.

Patinopecten yessoensis；hermaphrodite；self－fertilization；embryonic development；larval breeding

S917

A

1672－5174（2011）11－023－05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA10A401）；國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目（2005DKA30470）資助

2010－12－20；

2011－03－24

于瑞海（1964－），男，高級(jí)工程師，主要從事貝類育種研究。E－mail：yuruihai＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 王 莉