聶鴻濤,李 琪,于瑞海

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

刺參雌核發(fā)育二倍體的誘導及其早期生長發(fā)育*

聶鴻濤,李 琪**,于瑞海

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

紫外線照射使精子遺傳物質失活,用細胞松弛素B(CB)處理受精卵抑制第二極體釋放,誘導刺參(Apostichopus japonicus)雌核發(fā)育二倍體。用強度為2561μW/(cm2·s)的紫外線(254 nm)照射不同時間的精子與正常卵子受精。結果發(fā)現(xiàn)隨照射時間的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼蟲發(fā)生率逐漸降低,照射30 s時小耳幼蟲發(fā)生率降為0。受精后35 min,顯微鏡下觀察到有20%～30%受精卵排出第1極體時,用濃度0.5μg/mL的CB持續(xù)處理受精卵20 min,誘導出刺參第二極體抑制型雌核發(fā)育二倍體,雌核發(fā)育二倍體發(fā)育速度低于正常二倍體。微衛(wèi)星分析表明,雌核發(fā)育二倍體誘導成功率為93.3%。

刺參;紫外線照射;雌核發(fā)育;微衛(wèi)星

人工雌核發(fā)育是快速建立純合系、培育新品種、克隆及進行基因定位的有效手段。水產動物的人工雌核發(fā)育技術在魚類中研究的較多[1-4],通過人工雌核發(fā)育技術培育出了多種經濟魚類的克隆品系,如草魚、羅非魚、香魚、鯰魚、真鯛和牙鲆等。在海洋貝類中,貽貝(Mytilus edulis)[5]、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[6]、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)[7]、地中海貽貝(M.galloprovincialis)[8]、華貴櫛孔扇貝(ChlaMys nobilis)[9]、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[10]、櫛孔扇貝(C.farreri)[11]和馬氏珠母貝(Pinctadam artensii)[12]等種類也有研究報道,為基因著絲點作圖、快速建立純系、性別決定機制以及養(yǎng)殖新品種的開發(fā)等遺傳學和育種學研究提供了非常寶貴的實驗材料。迄今為止,棘皮動物的雌核發(fā)育研究僅在中間球海膽(Strongy locentrotus intermedius)[13]和馬糞海膽(Hem icentrotus pulcherrim us)[14]有報道。

刺參(Apostichopus japonicus),俗稱海參,屬棘皮動物門(Echinodermata),海參綱(Holothuroidea),楯手目(Aspidochirotida),刺參科(Stichopodidae),主要分布在俄羅斯、日本和朝鮮半島的北太平洋沿岸,在我國只分布于江蘇連云港以北海域。自1990年代以來,刺參已成為中國海水養(yǎng)殖業(yè)中最受青睞的養(yǎng)殖對象。開展刺參雌核發(fā)育二倍體人工誘導研究對于開展基因-著絲點圖譜構建、快速建立純系具有重要意義。本實驗以刺參為材料,研究了刺參雌核發(fā)育二倍體的人工誘導及早期生長特性,以期為海參的遺傳育種研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2010年5～6月在山東海陽市海泰育苗場進行。親參采自海陽沿海,挑選個體大,健壯的海參做為親參。親參入池后在水溫18～20℃海水中暫養(yǎng)。采用陰干流水升溫法誘導親參產卵,陰干1 h,流水刺激30 min,放入升溫海水(3～5℃)中,待其排精、產卵。親參排放后分別將精卵濃度調整為5.0×106/m L和2.0×103/m L。水溫維持在20～22℃,海水鹽度30～32。

1.2 雌核發(fā)育二倍體的誘導

1.2.1 紫外線處理精子 將2.0 m L精懸液均勻分散于直徑9.0 cm的塑料培養(yǎng)皿中,置于日本東芝公司生產的紫外燈(15 W)下15 cm處照射處理。用紫外線強度儀(美國Cole-Parmer公司)測得此條件下紫外線強度為2561μW/(cm2·s)。精子在紫外線下分別處理0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 s[19]。照射結束后分別與10 mL卵液混合受精,在500 m L燒杯中孵化培養(yǎng),溫度保持20～22℃。實驗重復3次。

1.2.2 卵子染色體的二倍化 根據(jù)精子紫外線照射條件的篩選,確定刺參精子遺傳失活的最佳紫外線照射時間。將最佳紫外線照射時間處理后的精液加入100 mL卵液中。受精35 min后,顯微鏡下觀察到有20%～30%受精卵排出第1極體時,用濃度0.5μg/mL的細胞松弛素B(CB)持續(xù)處理受精卵20 min。處理結束后用300目篩絹過濾洗卵,再放入0.1%的DM SO中浸泡30 min以去除殘留的CB,然后移入砂濾海水中孵化培養(yǎng)。

授精后5 h統(tǒng)計分裂卵數(shù)占總處理卵數(shù)的百分比得到卵裂率,授精后20 h統(tǒng)計囊胚和原腸期胚胎數(shù)占總受精卵數(shù)的百分比得到早期胚胎存活率,授精后40 h統(tǒng)計小耳幼蟲數(shù)占總幼蟲數(shù)的百分比得到小耳幼蟲發(fā)生率。每天隨機測量雌核發(fā)育二倍體組和對照組幼蟲的體長和體寬。采用不同的親參,重復實驗3次。

卵裂率(%)=卵裂細胞數(shù)/總觀察卵數(shù)×100,

早期胚胎存活率(%)=上浮囊胚和原腸期胚胎數(shù)/受精卵數(shù)×100,

小耳幼蟲發(fā)生率(%)=小耳幼蟲數(shù)/總幼蟲數(shù)×100。

1.3 DNA提取及微衛(wèi)星分析

利用微衛(wèi)星分析進行雌核發(fā)育二倍體的鑒定,以雄性親本特異等位基因的有無作為判斷是否為雌核發(fā)育后代。親本基因組DNA參照Li等[15]用CTAB法提取,雌核發(fā)育二倍體子代采用48 h小耳幼蟲,參照Li等[16]用Chelex樹脂提取。微衛(wèi)星引物的PCR反應體系、反應參數(shù)參照Li等[17]的方法。微衛(wèi)星引物序列、GenBank注冊號、重復序列及退火溫度見表1。反應程序于GeneAmp 9700型PCR儀(App lied Biosystem s公司)上進行,擴增產物于6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染顯色。

表1 刺參微衛(wèi)星引物序列和退火溫度Table 1 Sequences and annealing temperature of microsatellite p rimers in A postichopus japonicus

2 結果

2.1 精子遺傳失活

紫外線照射時間對刺參卵裂率、早期胚胎存活率、小耳幼蟲發(fā)生率產生了較大影響。由表2可見,在各照射組中,刺參卵裂率、早期胚胎存活率、小耳幼蟲發(fā)生率均隨著紫外線照射時間的延長而逐漸降低,其中當照射時間達到30 s時,卵裂率為74.3%(對照組為98.0%),早期胚胎存活率為50.0%(對照組為92.2%),小耳幼蟲發(fā)生率降低為0(對照組為88.8%)。

表2 紫外線照射時間與卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼蟲發(fā)生率的關系Table 2 Different impact of UV irradiation time on cleavage rate,survival rate at early embryonic phase and developmental rate of early auricularia

本實驗從遺傳失活照射梯度的結果可以看出,紫外線照射5～25 s,均有正常的二倍體小耳幼蟲出現(xiàn),表明5～25 s的照射強度不足以使刺參精子染色體完全遺傳失活。照射精子的時間達到30 s時,正常形態(tài)的二倍體小耳幼蟲完全消失,全部為畸形的雌核發(fā)育單倍體,因此用強度為2561μW/(cm2·s)的紫外線照射30 s是獲得刺參雌核發(fā)育單倍體的適宜劑量。

2.2 雌核發(fā)育二倍體人工誘導

表3顯示了刺參對照組和雌核發(fā)育二倍體組(G2N)幼蟲的發(fā)育速度。從表3可見,G2N組幼蟲個體發(fā)育速度慢于對照組幼蟲,第1天對照組有3.3%的小耳幼體,G2N組全為原腸期,第2天對照組有6.7%的中耳幼體,G2N組全為小耳幼體,第7天對照組有16.7%的大耳幼體,而G2N組沒有發(fā)現(xiàn)大耳幼體。發(fā)育至第9天,對照組發(fā)現(xiàn)3.3%的樽形幼體,而G2N組沒有發(fā)現(xiàn)樽形幼體。直至第11天,G2N組才出現(xiàn)樽形幼體,比例為5.9%,而此時對照組已投放附著基2 d,樽形幼體比例高達25%。

在生長方面,刺參對照組幼蟲的體長和體寬都大于G2N組幼蟲。圖1顯示了選育后1～9 d(G2N組和對照組均處于浮游幼蟲階段),對照組幼蟲的體長和體寬均大于G2N組幼蟲(見圖1),說明附著變態(tài)前刺參雌核發(fā)育二倍體的生長速度滯后于正常二倍體。

圖1 對照組和雌核發(fā)育二倍體組附著變態(tài)前的生長速度比較Fig.1 Grow th speed of larvae in control and gynogenesis groups before metamorphosis(?X±SD,n=3)

表3 對照組和雌核發(fā)育二倍體組附著變態(tài)前的發(fā)育速度Table 3 Development speed of larvae in control and gynogenetic dip loid groups beforemetamorphosis

從5對微衛(wèi)星引物中篩選得到2對父本具有特異等位基因的位點,PCR擴增結果顯示SJ33引物可擴增出清晰的親本差異條帶,父本存在特有等位基因(見圖2)。比較親本和子代的基因型,30個子代中有28個個體未出現(xiàn)父本的等位基因,表明是真正的雌核發(fā)育個體。此外,還有1個是正常二倍體(19),1個是污染個體(21)。本實驗雌核發(fā)育二倍體誘導成功率為93.3%。

圖2 引物SJ33在刺參親本及雌核發(fā)育子代中擴增的微衛(wèi)星圖譜Fig.2 Microsatellite locus amplified by SJ33 primer pairs in A.japonicus gynogenetic family

3 討論

人工誘導雌核發(fā)育需要精子的遺傳失活和較高的卵裂率,紫外線照射劑量過大,則導致精子失去受精能力,劑量不足,則不能滅活精子遺傳物質,得不到雌核發(fā)育個體。因此,要想獲得雌核發(fā)育單倍體關鍵是篩選適宜的紫外線照射劑量,即能使精子染色體完全失活而又不影響其受精能力。據(jù)報道,太平洋牡蠣雌核發(fā)育中精子失活的最佳誘導劑量是紫外線照射強度1080μW/(cm2·s),照射時間5～6 min[6];皺紋盤鮑為720μW/(cm2·s),20 s[7];地中海貽貝為620μW/(cm2·s),2 min[8];櫛孔扇貝為2561μW/(cm2·s),30 s[11]。因此,誘導精子遺傳失活的紫外線照射劑量因種類不同而有所差異,同時與精液的密度和厚度有關。

研究表明,精子染色體遺傳失活的原理是紫外線照射導致DNA氫鍵斷裂,使胸腺嘧啶之間形成胸腺嘧啶二聚體(thyminedimers),造成雙螺旋兩鏈間的氫鍵減弱,DNA結構局部變形,進而使DNA的正常復制與轉錄受到嚴重影響[18]。本實驗中卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼蟲發(fā)生率均隨著紫外線照射時間的延長而逐漸降低,其中照射30 s后小耳幼蟲發(fā)生率降為0。隨紫外線照射劑量的增加精子激活卵子的能力逐漸降低導致卵裂率逐漸下降,原因可能是精子的形態(tài)、結構和受精力受到破壞的程度增大,導致了精子受精能力的減弱,造成受精率的大幅下降[19]。Pan等[11]在櫛孔扇貝雌核發(fā)育誘導和細胞學觀察的研究中發(fā)現(xiàn),紫外線照射引起的損傷不僅包括精子的頂體和鞭毛受到破壞,其內部構造如核膜、細胞膜、線粒體嵴等也同樣受到傷害。

雌核發(fā)育個體的生長速度與正常個體有所不同,Scarpa等[8]報道地中海貽貝對照組幼蟲的個體大小總是大于雌核發(fā)育個體,且其附著變態(tài)的時間也比雌核發(fā)育幼蟲大約提前3周。Guo等[20]報道太平洋牡蠣雌核發(fā)育二倍體生長到8月齡時,與對照組個體大小差別很小。而侏儒蛤雌核發(fā)育個體發(fā)育到3月齡時,在大小和重量上與正常雌性個體沒有顯著差異Guo等[21]。Fujino等[22]則報道皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體的個體大小與正常二倍體相比差異較大。據(jù)李琪等[23]的報道,櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體的個體大小在孵化后前3 d小于對照組,以后大于對照組。本研究發(fā)現(xiàn)人工誘導產生的刺參雌核發(fā)育二倍體幼體發(fā)育速度慢于正常二倍體。由于是相同親本的精卵在同一環(huán)境中得到的實驗結果,排除了親本差異、卵質差異及孵化條件不同等因素的影響,推測可能是誘導過程中理化因素的改變造成發(fā)育速度滯緩。以前的研究表明,紫外線照射不僅造成精子遺傳物質受到破壞,同時還引起了精子入卵后的行為變化[24]。卵子的成熟分裂以及雌雄性原核的形成雖不受紫外線照射影響,但經紫外線照射的精子會使卵的發(fā)生速度出現(xiàn)滯緩,此現(xiàn)象在櫛孔扇貝[24]、太平洋牡蠣[25]和皺紋盤鮑[26]中也有相似的報道。

研究發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育的人工誘導過程中,紫外線照射劑量不足、照射不均一等因素都會導致精子遺傳物質失活不徹底,致使父本部分基因參與遺傳[19]。同時,Watson等[27]提出由紫外線引起的DNA損傷在特定的酶作用下可以被光修復,這同樣可以導致父本染色體的部分基因參與遺傳,因此有必要對雌核發(fā)育的真實性進一步確認。Li等[28]應用5對微衛(wèi)星引物證實了太平洋牡蠣人工雌核發(fā)育誘導成功率為100%,即沒有任何雄性基因參與遺傳;楊鳳影等[29]用5對微衛(wèi)星引物對櫛孔扇貝的雌核發(fā)育后代進行分析,雌核發(fā)育誘導成功率為70.2%。本研究用篩選出的2對微衛(wèi)星引物對刺參雌核發(fā)育二倍體家系進行鑒定,雌核發(fā)育誘導成功率為93.3%。本研究結果進一步證明了微衛(wèi)星標記鑒定方法是雌核發(fā)育鑒定分析的有效手段。

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Artificial Induction of Gynogenetic Diploids and Early Grow th in the Sea Cucumber Apostichopus japonicus

N IE Hong-Tao,LIQi,YU Rui-Hai
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Gynogenetic diploids in sea cucumber(A postichopus japonicus)were induced by means of ultraviolet(UV)radiation and cytochalasin B(CB)treatment for the inhibition of the second polar body release.The sperms irradiated by UV at an intensity of 2561μW/(cm2·s)for various durations were fertilized with the normal eggs.With increasing irradiation time,cleavage rate,survival rate at early embryonic phase and developmental rate of early auricularia decreased,and none of early auricularia occurred at 30 s.Thirty-fiveminutes later after fertilization,it could be observed under the op tical microscope that 20%～30%of eggs released the first polar body.Then the fertilized eggs were exposed to 0.5μg/m L CB for 20 min.Compared with those in the control group,the developmental speed in the gynogenetic diploid group was slower.Microsatellite analysis demonstrated that 93.3%of gynogenetic diploids were successfully induced.

Apostichopus japonicus;UV radiation;gynogenesis;microsatellite

S917

A

1672-5174(2011)09-031-05

山東省科技發(fā)展計劃項目(2009GG10005013);高等學校博士學科點基金項目(20090132110018)資助

2010-11-25;

2011-03-20

聶鴻濤(1984-),男,博士生,從事水產動物遺傳育種學研究。E-mail:nhtarnold361@yahoo.com

**通訊作者:Tel:0532-82031622;E-mail:qili66@ouc.edu.cn

責任編輯 王 莉