江麗麗，趙紅艷，馬 淼

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003；2新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054）

瀕危藥用植物天山雪蓮的根段組織培養(yǎng)與植株再生

江麗麗1，趙紅艷2，馬 淼1

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003；2新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054）

以瀕危藥用植物天山雪蓮根段為研究材料進(jìn)行組織培養(yǎng)和植株再生研究，旨在拓寬天山雪蓮組織培養(yǎng)外植體的范圍，建立高效植株再生體系，為其種群復(fù)壯、資源保護(hù)與可持續(xù)利用提供技術(shù)參考。研究結(jié)果表明：適合天山雪蓮根段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為 MS＋2，4－D（0.5 mg／L）＋NAA（2.0 mg／L），愈傷組織的誘導(dǎo)率為100%；適合其根段愈傷組織叢生芽分化的最佳培養(yǎng)基為 MS＋ NAA（0.05 mg／L）＋6－BA（0.4 mg／L），分化率為42.6%，增殖倍數(shù)為4.3；最佳生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋NAA（0.3 mg／L），在此條件下，根發(fā)育良好，生根率為76.9%，植株健壯；組培苗煉苗后移栽，成活率可達(dá)89%。

天山雪蓮；愈傷組織；叢生芽；植株再生；瀕危植物

天 山 雪 蓮 （Saussurea invol ucr ata Kar.et Kir.）系菊科多年生草本植物，為新疆特有物種。由于出色的抗炎、抗腫瘤及抗疲勞活性，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)天山雪蓮一直是傳統(tǒng)的名貴中藥材［1－3］。分布于高山雪線附近，生存環(huán)境惡劣。由于上世紀(jì)人們的過(guò)度采掘以及極低的種群自我更新能力，致使天山雪蓮種群規(guī)模銳減，數(shù)量急劇下降而成為國(guó)家二級(jí)瀕危物種［4－5］。盡管也曾有過(guò)利用種子進(jìn)行人工繁殖的研究報(bào)道，但由于較低的種子發(fā)芽率和較高的幼苗死亡率，所以人工的種子繁殖收效甚微。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段建立天山雪蓮的高效再生體系就顯得尤為重要。它不僅能夠?qū)崿F(xiàn)天山雪蓮的快速繁殖，而且還有助于發(fā)展天山雪蓮的人工種植業(yè)，以減輕對(duì)野生資源的采掘壓力。雖然有人也曾開(kāi)展過(guò)天山雪蓮的組織培養(yǎng)［6－8］，但由于其外植體類(lèi)型單一，僅限于種胚和葉片，而且增殖率和移栽成活率較低，很難滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，本文擬以天山雪蓮種子苗的幼嫩根段為外植體，探索高效的植株再生體系，旨在為天山雪蓮的人工栽培和種群復(fù)壯提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

天山雪蓮健康飽滿(mǎn)的種子于2008年9月采自新疆天山。用75%的酒精進(jìn)行種子表面消毒30 s，經(jīng)滅菌的蒸餾水漂洗后將種子置于0.1%Hg Cl2（W／V）溶液中浸泡7 min。然后用滅菌的蒸餾水充分漂洗，用滅菌的濾紙吸去種子表面過(guò)多的水分后，將種子接入1／2 MS培養(yǎng)基中，在25℃和16 h／d的冷光源光照條件下培養(yǎng)45 d獲得無(wú)菌苗，光照強(qiáng)度為40μmol／m2／s。

等無(wú)菌苗高度達(dá)到4 c m時(shí)，將其根切成長(zhǎng)度約為0.5 c m的小段，接種于附加了不同激素（2，4－D、NAA、6－BA）的 MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，28 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的顏色、質(zhì)地和誘導(dǎo)出愈率。將愈傷組織轉(zhuǎn)接在含有不同濃度NAA和6－BA以及500 mg／L水解乳蛋白（LH）的MS分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)63 d后統(tǒng)計(jì)再生苗的誘導(dǎo)分化頻率和增殖倍數(shù)。將顏色深綠、生長(zhǎng)健康的再生苗轉(zhuǎn)接到附加了不同濃度IAA或NAA的1／2 MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，40 d后統(tǒng)計(jì)生根率，記錄誘導(dǎo)生根條數(shù)并測(cè)量根長(zhǎng)。

以上MS培養(yǎng)基在配置時(shí)蔗糖的濃度控制為3% （w／v），p H 為5.8，瓊脂濃度為0.8% （w／v），并在121°C下滅菌20 min。培養(yǎng)間的溫度控制在25±1°C，16 h光照／8 h黑暗，用白色冷光源熒光燈照明，光照強(qiáng)度為40μmol／m2／s。

從培養(yǎng)基中取出生了根的再生苗，將根部用水漂洗干凈，移栽到盛有混合土（蛭石∶腐殖土＝1∶3）的口徑為16 c m的花盆中，每盆栽1株，置于溫室中培養(yǎng)。移栽苗上扣一個(gè)透明的塑料杯以提高杯內(nèi)的相對(duì)濕度，使相對(duì)濕度維持在90%左右，3周后開(kāi)始逐漸揭開(kāi)杯口，以適應(yīng)溫室內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境（晝／夜溫度為）25.6℃／16.8℃，苗盆處的光照強(qiáng)度為326μmol／m2／s，49 d后統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)天山雪蓮不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

來(lái)自天山雪蓮無(wú)菌苗幼嫩根段的外植體被接種于含有不同濃度2，4－D、NAA和6－BA的 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后兩端開(kāi)始膨大，28 d后絕大多數(shù)根產(chǎn)生啞鈴型黃綠色、致密愈傷組織（圖1a），28 d后統(tǒng)計(jì)根誘導(dǎo)的愈傷組織發(fā)生頻率（表1）。根段在0.1 mg／L 2，4－D與2 mg／L NAA 的 MS培養(yǎng)基中最高出愈率可達(dá)100%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2，4－D與NAA存在一定相互作用，當(dāng)2，4－D增加時(shí)所需NAA減少，2，4－D減少時(shí)所需NAA增加。通過(guò)比較以低濃度2，4－D與高濃度NAA組合更適合于根愈傷組織的誘導(dǎo)。單一激素NAA作用下也可誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織質(zhì)量較差，具體表現(xiàn)為玻璃化和褐化。

表1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)天山雪蓮根段愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響Tab.1 Effects of plant growth regulators on callus induction from root explant of S.involucr ata

2.2 6－BA、NAA與水解乳蛋白對(duì)天山雪蓮愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)效果的影響

將由根段誘導(dǎo)出的黃綠色、致密的愈傷組織塊接入含有不同劑量6－BA，NAA或水解乳蛋白的MS培養(yǎng)基中，4周后記錄幼苗分化頻率，10周后觀察并記錄叢生芽的誘導(dǎo)頻率和增殖倍數(shù)。結(jié)果顯示，外源物質(zhì)對(duì)幼苗分化和叢生芽的增殖影響顯著（圖1b、圖1c、表2）。適合愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)的最佳的分化培養(yǎng)基配方則為 MS＋0.05 mg／L NAA＋0.4 mg／L 6－BA，叢生芽的誘導(dǎo)頻率為42.6%，增殖倍數(shù)達(dá)4.3，水解乳蛋白對(duì)天山雪蓮根愈傷組織的誘導(dǎo)反而有顯著抑制作用。結(jié)果顯示只有在0.05 mg／L NAA＋0.4 mg／L 6－BA中可誘導(dǎo)出叢生芽，對(duì)NAA與6－BA濃度要求較葉片愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽嚴(yán)格，與其外植體類(lèi)型密不可分。叢生芽誘導(dǎo)增殖所需生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素濃度都較低，較高濃度NAA與6－BA組合會(huì)使愈傷組織褐化，不利于叢生芽的形成。

表2 外源物質(zhì)對(duì)天山雪蓮叢生芽誘導(dǎo)增殖效果的影響Tab.2 Effects of alien substances on proliferation of adventitious buds of S.involucrata

2.3 根的誘導(dǎo)分化

待叢生芽高度超過(guò)4 c m時(shí)，將其彼此分離并轉(zhuǎn)接到根系分化培養(yǎng)基中（1／2 MS培養(yǎng)基添加不同劑量的IAA或 NAA）。在1／2 MS＋I(xiàn)AA（0.1～0.5 mg／L）或1／2 MS＋NAA（0.2～0.5 mg／L）條件下，均可誘導(dǎo)分化產(chǎn)生新根。在接種14 d后開(kāi)始出現(xiàn)新根，42 d時(shí)根系發(fā)育達(dá)到良好，此時(shí)根系發(fā)育最佳的培養(yǎng)基條件為1／2 MS＋0.3 mg／L NAA，根誘導(dǎo)分化率達(dá)76.9%（圖1d、表3）。

表3 IAA與NAA對(duì)天山雪蓮誘導(dǎo)生根效果的影響Tab.3 Effects of IAA or NAA alone on root for mation fromregenerated shoots of S.involucrata

NAA誘導(dǎo)效果要明顯好于IAA的誘導(dǎo)效果，而且存在顯著性差異。當(dāng)NAA濃度大于0.3 mg／L時(shí)，隨著濃度升高，誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。

2.4 試管苗移栽

移栽的生根試管苗在溫室條件下生長(zhǎng)健康（圖1e），盆栽7周時(shí)存活率為89%。

圖1 天山雪蓮根段的組織培養(yǎng)與植株再生Fig.1 Plant regeneration from root explant of Saussurea involucrata

3 討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖用量甚微，但在植物組織培養(yǎng)中起著重要且明顯的調(diào)節(jié)作用。不同激素種類(lèi)及濃度搭配的合理選擇是組織培養(yǎng)初代誘導(dǎo)成功與否的關(guān)鍵。而針對(duì)不同外植體所需激素種類(lèi)及濃度搭配又各不相同。有文獻(xiàn)報(bào)道NAA與6－BA的組合最適合于天山雪蓮葉片愈傷組織誘導(dǎo)［9－10］，而本文的研究結(jié)果則表明2，4－D與NAA的組合最適合于天山雪蓮根愈傷組織誘導(dǎo)，這可能是由于天山雪蓮不同器官組織的發(fā)育習(xí)性存在差異造成的。2，4－D與NAA都屬于生長(zhǎng)素，都可誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)，因此兩者組合在一起時(shí)濃度不能都過(guò)高，或都過(guò)低，從而會(huì)抑制愈傷組織的誘導(dǎo)。而以較低濃度2，4－D與較高濃度NAA組合或較高濃度2，4－D與較低濃度NAA組合都較佳，試驗(yàn)結(jié)果表明較低濃度2，4－D與較高濃度NAA組合，根誘導(dǎo)愈傷組織率更高一些。

在由愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽分化的實(shí)驗(yàn)中，根愈傷組織與文獻(xiàn)中葉片愈傷組織所需的分化培養(yǎng)基之間也存在顯著不同［8］。這說(shuō)明來(lái)自同一植物不同器官的愈傷組織盡管遺傳組成完全相同，但分化成苗的潛力及其對(duì)環(huán)境的需求是完全不同的。NAA和6－BA 的激 素 組 合 在 雪 蓮 屬 的 其 他 物 種［7，11－12］以 及菊科的另外一些植物的幼苗誘導(dǎo)分化中都有過(guò)成功的運(yùn)用［13－14］，這說(shuō)明親緣關(guān)系相近植物類(lèi)群的組織培養(yǎng)條件又存在有某些共性特征。

生根培養(yǎng)多數(shù)使用生長(zhǎng)素，大都以IBA、IAA、NAA的單獨(dú)使用。按外植體類(lèi)型歸類(lèi)統(tǒng)計(jì)，愈傷組織分化根時(shí)，使用NAA最多，而胚軸、莖段、花梗等材料分化根時(shí)，使用IAA居首位。由此可見(jiàn)，在不定根形成中植物激素起決定性作用，生長(zhǎng)素都能促進(jìn)生根。在本試驗(yàn)中NAA誘導(dǎo)效果要明顯好于IAA的誘導(dǎo)效果。生根培養(yǎng)基中NAA的最適濃度為0.3 mg／L，這與徐春明等發(fā)表的以葉片為外植體NAA濃度超過(guò)0.1 mg／L后天山雪蓮根分化完全受到抑制，分化率降低到零的研究結(jié)果存在差異［15］，這可能是因?yàn)椴煌庵搀w誘導(dǎo)的組培苗的差異性使得生根所需激素濃度不同。

本文嘗試了以天山雪蓮根系→誘導(dǎo)愈傷組織→誘導(dǎo)分化獲得叢生苗→誘導(dǎo)生根→移栽的研究，拓寬了天山雪蓮組織培養(yǎng)工作中外植體的選擇范圍。天山雪蓮高效組培體系的建立為該傳統(tǒng)中藥材原植物的種群人工復(fù)壯、種群保護(hù)和栽培利用提供了技術(shù)依據(jù)。

［1］李君山，朱兆儀，蔡少青.雪蓮花類(lèi)商品藥材調(diào)查［J］.中國(guó)中藥雜志，2000，25（8）：461－465.

［2］黃繼紅，譚敦炎.雪蓮的研究進(jìn)展新疆［J］.農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（2）：8－13.

［3］袁曉凡，趙兵，王玉春.雪蓮的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2004，35（12）：1424－1426.

［4］楊戈，阿布力米提·阿布都卡迪爾.中國(guó)天山山區(qū)藥用植物資源及其保護(hù)與利用［J］.干旱區(qū)研究，2001，18（2）：31－37.

［5］賈莉芳，王曉軍，趙民安.新疆雪蓮體細(xì)胞胚胎發(fā)生［J］.植物學(xué)通報(bào)，2008，25（1）：85－88.

［6］武利勤，郭順星，肖培根.新疆雪蓮胚芽的組織培養(yǎng)和植株再生［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30（11）：814－816.

［7］Guo B，Gao M，Liu C Z.In vitro propagation of an endangered medicinal plant Saussurea invol ucr ata Kar.et Kir［J］.Plant Cell Rep，2007，26（3）：261－265.

［8］趙海清，王曉軍.新疆天山雪蓮組培快繁技術(shù)的建立［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：2743－2746.

［9］賈景明，吳春福，吳立軍，等.天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)與次生代謝物形成的研究［J］.中藥研究與信息，2005，7（7）：11－15.

［10］胡雪梅，秦麗，賀賓，等.新疆雪蓮組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，44（3）：333－335.

［11］Dhar U，Joshi M.Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata （DC.）Edgew.（Asteraceae）：effect of explant type，age and plant growth regulators［J］.Plant Cell Rep，2005，24（4）：195－200.

［12］Joshi M，Dhar U.In vitro propagation of Saussurea obvall ata （DC.）Edgew.－an endangerd ethnoreligious medicinal her b of Himalaya［J］.Plant Cell Rep，2003，21（10）：933－939.

［13］Baker M C，Munoz－Fernandez N，Carter C D Improved sheet development and rooting from mature leaves and roots of Eryngium foetidum L.，a food flavouring agent［J］.Curr Sci，1999，75（1）：644－666.

［14］Knittel N，Escandon A S，Hahne G.Plant regeneration at high frequency fro m mat ure sunflower cotyledons［J］.Plant Sci，1991，（73）：219－226.

［15］徐春明，趙兵，耿楠，等.植物激素和活性炭對(duì)新疆雪蓮組培苗生根的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：41－43.

In Vitro Micro－propagation of Saussurea Involucrata an Endangered Chinese Medicinal Her b

JIANG Lili1，ZHAO Hongyan2，MA Miao1
（1 College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2 College of Life Science，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

An efficient micro－propagation system for Saussureainvol ucrata Kar.et Kir.an endangered Chinese medicinal plant，has been developed.100%callus formation frequency was got fro m root explants inoculated on a MS medium containing 0.5 mg／L 2，4－D and 2 mg／L NAA （1－Naphthaleneacetic acid）.42.6%of adventitious bud or ganogenesis frequency and 4.3 buds per explant were got from root－derived callus when cultured on a MS medium supplemented with 0.05 mg／L NAA，0.4 mg／L 6－BA.Up to 76.9%of the regenerated shoots for med complete roots on a half－strength MS medium containing 0.3 mg／L NAA，and 89%of the complete plantlets survived and grew vigorously under greenhouse condition.

Saussureainvolucr ate；callus；adventitious bud；micro－propagation；endangered species

R944.4

A

1007－7383（2011）03－0343－04

2011－01－29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30960028）

江麗麗（1984－），女，碩士生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)橘Y源植物學(xué)。

馬淼（1970－），男，教授，從事資源植物學(xué)研究；e－mail：miao m＠shzu.edu.cn。