翟志斌，王月英，張 恒，吳紅英，李德冠，路 璐，常建輝，王小春，孟愛民

(北京協(xié)和醫(yī)學院 放射醫(yī)學研究所 天津市分子和醫(yī)學重點實驗室，天津 300192)

SB203580對小鼠造血組織輻射損傷的保護作用

翟志斌，王月英，張 恒，吳紅英，李德冠，路 璐，常建輝，王小春，孟愛民

(北京協(xié)和醫(yī)學院 放射醫(yī)學研究所 天津市分子和醫(yī)學重點實驗室，天津 300192)

目的 觀察SB203580對接受γ射線照射的C57BL/6小鼠造血組織損傷的保護作用。方法 小鼠隨機分為對照(Ctr)組、照射(IR)組及SB203580給藥(SB)組，以6.0 Gy137Csγ射線全身均勻照射SB組和IR組的C57BL/6小鼠。收集并計數(shù)外周血紅細胞、白細胞和血小板，以及單側(cè)股骨骨髓有核細胞(BMMNC);骨髓細胞半固體培養(yǎng)法檢測BMMNC增殖能力。另外收集小鼠BMMNC，同樣分組，IR組與SB組細胞進行1 Gy體外照射，照射之后孵育過夜，酶標儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果 SB組外周血白細胞、血小板的數(shù)量分別比IR組高111.8%和157.7%(P ＜0.05);SB 組 BMMNC 較 IR 組高135.4%，CFU-GM 高188.5%(P ＜0.05);SB 組 BMMNC內(nèi)ROS較IR組低56.2%(P＜0.05)。結(jié)論 SB203580對照射造成的小鼠造血組織損傷具有一定的保護作用，這種保護作用可能與其降低照射后細胞內(nèi)ROS水平有關。

SB203580;骨髓有核細胞;單核-粒細胞集落形成單位;活性氧

造血組織是一類輻射敏感組織，電離輻射造成造血組織損傷可導致貧血、出血和免疫力降低，是核輻射事故與放射治療中患者死亡的主要原因之一。電離輻射可使DNA造成損傷，同時激活應激通路。p38 MAPK是重要的應激通路蛋白。電離輻射可能通過作用于機體產(chǎn)生的活性氧(ROS)激活 p38 MAPK，導致組織損傷［1］。本文選擇p38MAPK的特異性抑制劑SB203580，通過外周血細胞與骨髓有核細胞計數(shù)，以及集落形成實驗觀察其對于血液系統(tǒng)的保護作用，另外，通過 ROS實驗初步探討SB20358對造血組織起到保護作用的機制，為研發(fā)相關輻射防護劑提供實驗依據(jù)。

1 材料

SB203580購自LC Laboratories;ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所;甲基纖維素培養(yǎng)基購自Stemcell Technology有限公司;Ficoll淋巴細胞分離液購自天津美德太平洋有限公司。

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體重20～22 g，由維通利華實驗動物有限責任公司提供，合格證號:SCXK(京)2002-0003。

日本sysmex poch-100i全自動血液分析儀;瑞士TECAN公司infinite2000多功能酶標儀。

2 方法

2.1 照射條件

137Csγ射線進行一次性全身6.0 Gy照射(輻射源購自加拿大原子能有限公司)，劑量率為0.88 Gy/min;體外照射股骨骨髓有核細胞(BMMNC)，照射劑量為 1 Gy，劑量率為 0.76 Gy/min。

2.2 分組及給藥

將C57BL/6小鼠分為對照(Ctr)組、照射(IR)組和SB203580給藥(SB)組，每組10只。對照組接受假照射，其余2組進行劑量為6.0 Gy的γ射線一次性全身照射。SB組于照射前30 min腹腔注射SB203580 15 mg/kg，照射后24 h繼續(xù)給藥，隔日1次，共5次，Ctr組和IR組給予等體積二甲亞砜(DMSO)。

2.3 觀察指標與方法

2.3.1 細胞計數(shù) 末次給藥24 h后，眼靜脈叢取血，計數(shù)紅細胞、白細胞和血小板。另取小鼠一側(cè)股骨，2 mL注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液1 mL沖洗股骨，得到骨髓細胞懸液，用血細胞分析儀計數(shù)BMMNC。

2.3.2 單核-粒細胞集落形成單位(CFU-GM) 末次給藥24 h后，取雙側(cè)股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液沖洗，收集骨髓細胞。計數(shù)后加入甲基纖維素培養(yǎng)基中，接種至24孔板內(nèi)。于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d。于第6天，在倒置顯微鏡下計數(shù)陽性集落(細胞數(shù)＞30的細胞集落為陽性集落)。結(jié)果以每105細胞形成的陽性集落數(shù)來表示。

2.3.3 ROS 另取正常C57BL/6雄性小鼠6只，處死后取雙側(cè)股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液沖洗，收集骨髓細胞。骨髓細胞經(jīng)Ficoll密度梯度離心得到BMMNC，將細胞分為Ctr組、IR組和SB組，每組含1×106細胞，其中IR組和SB組接受1 Gyγ射線照射，SB組在照射前在37℃、5%CO2，含 1μmol/L SB203580的培養(yǎng)基內(nèi)孵育30 min，Ctr組與IR組接受與SB組等量的DMSO。接受照射之后各組細胞接種至24孔板，在37℃、5%CO2，飽和濕度的條件下過夜。樣本處理依照檢測試劑盒使用說明，多功能酶標儀在激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm的條件下檢測細胞內(nèi)DCF熒光強度。DCF熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平。

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 SB203580緩解電離輻射導致的血液細胞數(shù)目下降

結(jié)果見表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR組)外周血紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板較Ctr組分別低29.9%，97.1%和 95.4%(P ＜0.01);經(jīng)SB203580干預之后(SB 組)，RBC、WBC、血小板較 Ctr組分別低 29.9%，93.9% 和 88.0%(P ＜0.01)，與 IR 組比較，WBC 高 111.8%(P ＜0.05)，血小板高157.7%(P ＜0.01)。

3.2 SB203580對骨髓有核細胞的保護作用

結(jié)果見表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR組)BMMNC 較 Ctr組低80.9%(P ＜0.01);CFU-GM較 Ctr組低 95.7%(P ＜0.01);給予 SB203580 后(SB 組)，BMMNC 比 Ctr組低86.2%(P ＜0.01)，比IR組高 135.4%(P ＜0.01)，CFU-GM 比 Ctr組低55.0%(P ＜0.01)，比 IR 組高 188.5%(P ＜0.05)。說明SB203580可以抑制小鼠全身照射后引起的造血功能下降。

3.3 SB203580的抗氧化作用

ROS的測定結(jié)果見表1。經(jīng)1 Gyγ射線照射后，IR組BMMNC內(nèi) ROS較 Ctr組高69.5%(P＜0.05);SB組BMMNC內(nèi)ROS產(chǎn)生較IR組低56.2%(P ＜0.05)。

表1 SB203580預防給藥對小鼠全身照射血液系統(tǒng)的保護作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

表1 SB203580預防給藥對小鼠全身照射血液系統(tǒng)的保護作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

與 Ctr組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01; 與 IR 組比較:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01Compared with Ctr group:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01;Compared with IR group:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01

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4 討論

受到放射損傷后的機體大多會出現(xiàn)貧血、感染和出血等癥狀，并且，外周血RBC、WBC、血小板數(shù)目低下。外周血細胞數(shù)目低下與造血組織損傷密切相關。損傷后血液功能和造血功能的恢復依賴于殘存的具有造血功能的BMMNC的數(shù)目和能力。我們通過實驗觀察到SB203580可以緩解電離輻射導致的WBC和血小板數(shù)目下降，另外，SB203580可以緩解單側(cè)股骨BMMNC數(shù)目的下降，還通過反映造血祖細胞的增殖能力的CFU-GM實驗觀察到SB203580可以緩解電離輻射導致的骨髓造血功能抑制。SB203580表現(xiàn)出對造血組織具有一定的輻射保護作用。

目前，盡管多項研究顯示p38 MAPK接到的信號轉(zhuǎn)導通路在自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤、阿爾茲海默病和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用［2］，SB203580可以通過抑制凋亡相關信號通路中的關鍵因子Bax蛋白的移位，抑制缺血性心肌病引發(fā)的心肌細胞凋亡［3］，但SB203580對電離輻射誘導的骨髓損傷的保護作用還鮮有報道。本次實驗為期10余天，實驗小鼠正處于輻射損傷的急性期，電離輻射所致細胞凋亡是造成造血組織損傷的主要原因。而SB203580除了可以抑制p38 MAPK活性，我們的實驗還發(fā)現(xiàn)它可以在短期內(nèi)通過抑制細胞內(nèi)ROS的生成。Ichijo等［1］研究顯示電離輻射產(chǎn)生的ROS可以通過激活p38 MAPK上游激酶ASK1引發(fā)細胞凋亡，我們的實驗顯示SB203580可能通過抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而抑制凋亡相關信號轉(zhuǎn)導，保護造血組織。

同時，在臨床實踐中，電離輻射對骨髓造血功能的長期抑制是輻射損傷患者死亡的重要原因之一。我們的前期實驗［4-6］發(fā)現(xiàn)caspase-3的抑制劑z-VAD可以抑制電離輻射誘導的造血細胞凋亡，但是對于輻射誘導的骨髓細胞增殖能力長期抑制只有部分糾正，而這種長期抑制由造血干細胞的永久性損傷所導致。Ito等［7］研究表明 ROS可以通過激活 p38 MAPK，可長期抑制造血干細胞的功能，提示SB203580不僅可以抑制凋亡保護骨髓造血功能，它還可能具有緩解電離輻射導致的造血功能的長期抑制的作用。接下來我們將會進一步觀察SB203580對電離輻射誘導的骨髓造血功能長期抑制是否具有保護作用，并探討相關的分子機制。

［1］Ichijo H，Nishida E，Irie K，et al.Induction of apoptosis by ASK1，a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways［J］.Science，1997，275(5296):90-94.

［2］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP-kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358-1375.

［3］Capano M，Crompton M.Bax translocates to mitochondria of heart cells during simulated ischaemia:involvement of AMP-activated and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Biochem J，2006，395(1):57-64.

［4］Wang Y，Schulte B A，LaRue A C，et al.Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence［J］.Blood，2006，107(1):358-366.

［5］Meng A，Wang Y，Brown SA，et al.Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosis-dependent and-independent mechanisms［J］.Exp Hematol，2003，31(12):1348-1356.

［6］Meng A，Wang Y，Van Zant G，et al.Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells［J］.Cancer Res，2003，63(17):5414-5419.

［7］Ito K，Hirao A，Arai F，et al.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells［J］.Nat Med，2006，12(4):446-451.

The protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue exposed to irradiation

ZHAI Zhi-bin，WANG Yue-ying，ZHANG Heng，WU Hong-ying，LI De-guan，LU Lu，CHANG Jian-hui，WANG Xiao-chun，MENG Ai-min
(Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Institute of Radiation Medicine，Peking Union Medical College，Tianjin 300192，China)

Purpose To investigate the protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue of C57BL/6 mice injured by γ-ray.Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into control group(Ctr)，irradiation group(IR)and SB203580 treatment group(SB).Mice were intraperitoneal injected SB(15 mg/kg)30 minutes ahead of TBI and then given every 2 days for 5 times after the TBI.On day 11，peripheral blood count and nucleated femoral cell count were performed by blood analyzer.1 × 105cells were seeded into Methocult GF M3534 methylcellulose medium and colony-forming units-granulocyte and monocyte(CFU-GM)were scored on day 6.DCFH as a fluorescent probe assessed the reactive oxygen species(ROS)generation in overnight incubated bone marrow mononuclear cells(BMMNC)，which were irradiated at 1 Gy.Results Transitory and significant changes occurred in the cell amount of BMMNCin the irradiated mice after administration of SB203580:white blood cells，platelets and BMMNC in SB were significantly increased by 111.8%，157.7%and 135.4%(P ＜0.05).The proliferation suppression of BMMNC in IR group was eased by SB203580 injection and CFU-GM in SB group score rises by 118.5%(P ＜0.05).Moreover，ROSgets back to the normal level observed in SB group.Conclusion It was shown that changing with cell count and enhancing of proliferation manifested the protection of SB203580 from radiation induced hematopoietic tissue injury.The protection of SB203580 may attribute to its suppression on ROSgeneration.

book=86,ebook=18

SB203580;bone marrow mononuclear cells;colony-forming unit-granulocyte and monocyte;reactive oxygen species

R962

A

1005-1678(2011)02-0085-03

2010-09-20

國家自然科學基金資助項目(30828011，30770645);天津市自然科學基金資項目(08JCYBJC07300)

翟志斌，男，在讀碩士研究生;孟愛民，通信作者，研究員，博士生導師，E-mail:ai-min-meng@126.com。