陳 群，徐 平，王順旺，李 彬，張 麗，宋凱英

(1.遵義醫(yī)學院 附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003;2.廈門市第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，福建 廈門 361100)

阿爾茨海默病是臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，常見于老年前期和老年期的漸進性大腦退行性疾病，也是老年性癡呆的一種主要類型。目前，對癡呆的防治尚無理想藥物，已有藥物主要為乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑，如他克林、多奈哌齊等。但療效有限且毒性較大而使臨床應用受限。中醫(yī)藥防治該病方法多樣、療效滿意，已引起廣泛關(guān)注［1-2］。白藜蘆醇(Res)是一種植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、花生、藜蘆等植物中，近十幾年來人們對Res多方面的研究結(jié)果證實其具有許多重要的生理活性，如:抗氧化、抗癌、保護心血管系統(tǒng)、雌激素樣作用、延緩衰老、影響骨代謝等［3-4］。本文觀察了反式白藜蘆醇(Trans-resveratrol，TR)對β-淀粉樣肽(Aβ25-35)損傷大鼠的海馬周圍皮層神經(jīng)元的作用。

1 材料

TR(純度:98%)、DHT苦味酸、RNAiso Regent液、熒光液Green Supermix、caspase-8、caspase-9 優(yōu)化引物，廣州華拓生物有限公司;Aβ25-35(Amyloidβ-Protein Fragment 25-35，批號 A4559)，Sigma公司。

SPF級SD雄性大白鼠，體重為300～350 g，第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所動物室提供，許可證號scxk(渝)2007-0005。

iCycler熒光定量PCR儀，美國 BioRad公司;Mastercycler Gradient PCR儀，德國Eppendorf;TU1810紫外可見分光光度計，北京普析儀器有限責任公司。

2 方法

2.1 造模及分組

Aβ25-35用生理鹽水溶解制成1μg/μL溶液孵育12 h后使用。SPF級SD雄性大白鼠72只，Morris水迷宮訓練3 d，成績穩(wěn)定后，剔除逃避潛伏期＜5 s和＞50 s的大鼠，合格的70只隨機分為5組:假手術(shù)組;模型組;TR高、低劑量組和多奈哌齊對照組。除假手術(shù)組外，其他各組造模。大鼠稱重，用5%水合氯醛0.7mL/100 g腹腔注射麻醉后固定于雙臂腦立體定位儀上，局部頭頂去毛、消毒，正中矢狀位切口，將骨膜分離、剝除，確定前、后囟，并使之處于同一水平面上，取前囟為0點，切開后選擇雙側(cè)海馬旁回為注射靶區(qū)(前囟后3.0 mm，中線左右旁開2.2 mm，硬腦膜下2.8 mm)，定位后用顱鉆孔，分別將 Aβ25-35溶液5μL緩慢注入雙側(cè)海馬旁回［5］，每側(cè)注射結(jié)束后留針5 min，用牙托粉和502膠混合物封閉鉆孔［5］，縫合切口。假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。

2.2 給藥

TR用生理鹽水溶解制成不同濃度的溶液，制模結(jié)束大鼠清醒后開始給藥。TR高、低劑量組分別給予TR 40，10mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水，對照組給予多奈哌齊1.75mg/(kg·d)，灌胃給藥，共10d。

2.3 取材

在造模后第11天每組取大鼠7只經(jīng)10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，斷頭取腦，置于冰水混合的人工腦脊液里［5］，用病理切片刀切取雙側(cè)海馬及周圍腦組織放入10%福爾馬林中固定24 h以上用于TUNEL檢測，判斷造模是否成功，以便及時補充模型鼠。大鼠的學習記憶功能檢測結(jié)束后(約制模后第17天)，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，取腦，置于冰水混合的人工腦脊液里［6］，用病理切片刀切取一側(cè)海馬及周圍腦組織放入10%福爾馬林中固定24 h以上用于TUNEL檢測，切取另一側(cè)海馬及周圍腦組織放入加有RNA萃取液0.5mL的EP管中，－80℃速凍用于real time RTPCR檢測。

2.4 檢測法

2.4.1 TUNEL法檢測大鼠海馬及周邊腦組織細胞凋亡情況 10%福爾馬林處理后用防脫載玻片制作石蠟切片病理標本，脫蠟水化，PBS沖洗2次(3 min/次，下同)。在0.1%TrionX-100枸櫞酸鈉滲透液上(2～8℃)孵育8 min，PBS沖洗2次。擦干組織周圍水份，每片加TUNEL反應液50μL(陰性對照2張片子不加TUNEL反應液，只加Label solution 50μL)于濕化盒中37℃、避光孵育60 min，PBS沖洗3次。擦干組織周圍水份，避光條件下，在片子上滴1滴PBS放在熒光顯微鏡(400×)上看，每組看6個片，每張片看8個視野。按照Roche公司試劑盒說明書操作，然后在高倍鏡下(400×)下計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，即每張片選取10個細胞數(shù)最多的不重疊高倍視野計算出每個視野中凋亡細胞與總細胞數(shù)的百分比，計算8個視野的平均凋亡細胞百分數(shù)及平均凋亡細胞百分數(shù)(每組7個樣本切片)。

2.4.2 real time RT-PCR法檢測大鼠海馬及皮質(zhì)caspase-8、caspase-9的表達 按文獻［7］方法及試劑盒說明書提取、純化RNA，測定RNA含量，進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。與試劑盒說明書不同的是所加入的引物。目的基因表達的相對定量法:以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，依次計算下列數(shù)據(jù)，Ct值的平均值=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復管);dCt=Ct值的平均值－中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值，即中位數(shù));基因的表達=2－dCt。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 TR對大鼠海馬旁回神經(jīng)細胞凋亡的影響

TR對大鼠海馬旁回神經(jīng)細胞凋亡的影響按照5組的不同情況，自試驗中截圖，見圖1。

TUNEL染色檢測再灌注后觀察海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡水平。用原位凋亡專用試劑盒處理后，利用顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)軟件計數(shù)海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)。模型組大鼠海馬區(qū)可見散在的弱陽性細胞，胞體較大，著色淺。7d后低劑量組的腦缺血模型組海馬區(qū)的陽性細胞數(shù)明顯增多，著色較深，多為胞漿著色。而高劑量組陽性細胞明顯增多，但是卻變成淡色著色，說明高劑量組的效果不如低劑量組的效果凋亡水平;假手術(shù)組和對照組的細胞數(shù)胞體較大，著色淺，說明凋亡效果不如高、低劑量組和模型組。

圖1 模型組(A)、低劑量組(B)、高劑量組(C)、假手術(shù)組(D)和對照組(E)細胞的凋亡顯示(圓圈、黑色標注箭頭分別示五組模型組海馬的凋亡小體)Fig.1 Hippocampal apoptotic body of model group(A)，low dosage group(B)，high-dosage group(C)，sham group(D)and control groups(E)(An arrow shows hippocampal apoptotic body)

假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組和對照組的凋亡率分別為4.64%，27.2%，16.7%，14.2%和9.12%。模型組凋亡率最高，其次是低劑量組，它們與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組和對照組的凋亡率與假手術(shù)組比較也有顯著差異(P＜0.05)。

3.2 real time RT-PCR法檢測大鼠海馬及皮質(zhì)caspase-8、caspase-9 的表達

結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織切片中可見少量caspase-9陽性細胞表達，腦缺血模型組在造模7d后海馬區(qū)caspase-9陽性細胞數(shù)明顯增多。模型組中caspase-8和caspase-9的表達最高，對照組次之，與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P＜0.01);高劑量和低劑量與假手術(shù)組相比，也有顯著差異(P＜0.05)。另外，低劑量組與高劑量組比較，也有顯著差異(P＜0.05)。

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各組的表達(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各組的表達(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01，2 P＜0.05;與高劑量組比較:3 P＜0.05Compared with sham group:1 P＜ 0.01，2P＜0.05;Compared with high-dosage group:3 P＜0.05

?

4 討論

阿爾茨海默病發(fā)病機制復雜，主要有遺傳因素、炎癥免疫學說、自由基學說、膽堿能學說、鋁中毒學說等。有一個共識正在逐漸形成:即β淀粉樣蛋白(Aβ)肽的生成和蓄積是阿爾茨海默病發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)。β-淀粉樣是神經(jīng)毒性物質(zhì)，有研究表明邊緣系統(tǒng)注射入Aβ25-35后會先表現(xiàn)為caspase激活，在細胞凋亡途徑中，caspase-8是關(guān)鍵的啟動型caspase，caspase-8的活化是caspase級聯(lián)反應的第一步，caspase-3是該途徑的最后執(zhí)行者，然后才有神經(jīng)元的損傷［8］。本實驗用TUNEL法檢測大鼠海馬及周邊腦組織細胞凋亡情況，模型組與其他各組有差異(P＜0.01)，進一步說明造模成功。PCR檢測的caspase-8和caspase-9的mRNA的表達結(jié)果進一步表明，TR對Aβ25-35引起的腦細胞的炎癥及凋亡反應有抑制作用，說明TR對Aβ25-35損傷模型老鼠可能有部分保護作用，其機制可能是抑制Aβ25-35引起的炎癥反應，下調(diào)caspases-8、caspases-9mRNA的表達，從而減輕神經(jīng)元的損傷。對于TR作用的量效關(guān)系還有待進一步研究。

在本實驗研究過程中發(fā)現(xiàn)損傷海馬旁回后，部分大鼠出現(xiàn)精神分裂癥的類似癥狀。相關(guān)資料表明，海馬旁回失活后可出現(xiàn)精神分裂癥幻聽等［9］。功能分區(qū)研究也表明，海馬旁回在高度復雜的記憶場景中起關(guān)鍵作用［10］，邊緣系統(tǒng)(包括海馬，海馬旁回)異常與大鼠學習記憶障礙有關(guān)，可能有助于精神分裂癥和暴力行為的神經(jīng)心理障礙研究，該研究可能成為進一步查明暴力行為的神經(jīng)生物化學基礎［11］。TR是否可以成為治療精神分裂癥的新藥物，還有待進一步研究。但是它的可能性也為我們今后在探索治療精神分裂癥方面提供了新的思路。

［1］白慧梅.中醫(yī)藥治療老年性癡呆臨床研究概況［J］.河北中醫(yī)，2008，30(6):658-660.

［2］李 瀟，孫永福，王鳳山.低分子多糖在阿爾茨海默病防治中的研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(5):344-347

［3］王紅梅，石彥國，李 想，等.白藜蘆醇的功能性和前景展望［J］.中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2008，12:213.

［4］許書見，黃星星，朱瑞芳，等.白藜蘆醇對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(6):375-378.

［5］孫世曉，張皓婷，潘培坤，等.愈呆方對誘導癡呆模型大鼠學習記憶能力影響的研究［J］.中醫(yī)藥信息，2009，26(6):53-54.

［6］Hebert L E，Beckett L A，Scherr P A，etal.Annual incidence of Alzheimer disease in the United States projected to the years 2000 through 2050［J］.Alzheimer Dis Assoc Disord，2001，15:169-173.

［7］Gong Q H，Wang Q，Shi J S，etal.Inhibition of caspases and the intracellular free Ca2+concentration are involved in resveratrol protection against apoptosis in rat primary neuron cultures［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28:1724-1730.

［8］Arif M，Chikuma T，Ahmed M M，etal.Effects of memantine on soluble Alphabeta(25-35)-induced changes in peptidergic and glial cells in Alzheimer's disease model rat brain regions［J］.Neuroscience，2009，164(3):1199-1209.

［9］Diederen K M，Neggers S F，Daalman K，etal.Deactivation of the parahippocampal gyrus preceding auditory hallucinations in schizophrenia［J］.Am J Psychiatry，2010，167(4):427-435.

［10］Chai X J，Ofen N，Jacobs L F，etal.Scene complexity:influence on perception，memory，and development in the medial temporal lobe［J］.Front Hum Neurosci，2010，5:21-25.

［11］Yang Y，Raine A，Han C B，etal.Reduced hippocampal and parahippocampal volumes in murderers with schizophrenia［J］.Psychiatry Res，2010，182(1):9-13.