于海珍，范海霞，徐 波

●研究報道

有氧跑臺訓(xùn)練對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬內(nèi)CREB mRNA表達的影響

于海珍1，范海霞2，徐 波3

目的：研究8周有氧跑臺訓(xùn)練對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬內(nèi)CREBmRNA表達的影響。材料與方法：選用健康雄性SD大鼠20只，隨機分為安靜對照組（C組，n=10）和運動訓(xùn)練組（T組，n=10），運動組進行為期8周的有氧跑臺訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5次，第8周對C組和T組進行為期6天的Morris水迷宮實驗，使用實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠海馬CREBmRNA的表達水平。結(jié)果：8周有氧跑臺訓(xùn)練增強T組大鼠在Morris水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力，同時上調(diào)T組大鼠海馬內(nèi)CREB（上調(diào)28.8%）的基因表達。結(jié)論：8周有氧跑臺訓(xùn)練促進大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與跑臺訓(xùn)練顯著上調(diào)大鼠海馬CREBmRNA的表達有關(guān)。

有氧跑臺訓(xùn)練；學(xué)習(xí)記憶；海馬；CREB

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)了解到一些與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因及其功能，其中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）就是一種重要的核轉(zhuǎn)錄增強因子，它具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能，它能夠刺激特定基因，制造蛋白質(zhì)，強化細胞彼此的連接。S.Vaynman等研究表明，成年SD大鼠分別進行3天和7天的自愿跑輪運動，其CREBmRNA水平顯著升高（P＜0.05），3天后上調(diào)到118%，7天后上調(diào)到136%，并認為跑輪訓(xùn)練提高大鼠海馬可塑性可能與運動誘導(dǎo)CREBmRNA升高有關(guān)[1]。Shen等人報道一次自愿跑輪運動可增加大鼠海馬磷酸化的CREB，而且發(fā)現(xiàn)，CREB與BDNF基因CRE序列的結(jié)合增加，增強CREB靶基因BDNF基因的轉(zhuǎn)錄，CREB的激活水平可持續(xù)一周[2]。Vaynman等發(fā)現(xiàn)一周自愿運動不僅可增加大鼠海馬CREB活性，而且發(fā)現(xiàn)CREBmRNA表達增加，同時實驗動物水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力加強[3]。這些研究表明，一周內(nèi)的自愿跑輪運動都能增加CREB的基因表達，即短期的有氧運動能增強CREBmRNA的表達，那么長期的有規(guī)律的有氧運動是否能增強CREB基因表達呢？基于這方面的思考，本研究將以大鼠為實驗對象，研究8周有規(guī)律的有氧跑臺訓(xùn)練對大鼠CREB基因表達和學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及訓(xùn)練模型

健康雄性6周齡Sprague－Dawley（SD）大鼠20只，體重（164.92±3.10）g，由中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007－0003。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。動物飼養(yǎng)環(huán)境：通風(fēng)，自然光照，室溫（22±1）℃。實驗前，隨機將大鼠分為安靜對照組（C組，n=10）和運動實驗組（T組，n= 10），采用喬山跑臺改裝成的動物實驗跑臺，直接對T組大鼠進行8周正式的有氧跑臺訓(xùn)練，每周運動5次，訓(xùn)練均安排在每周的周二至周六晚間進行。第8周對所有動物進行Morris水迷宮學(xué)習(xí)測試，均在上下午進行。另外，根據(jù)嚙齒類動物的生活習(xí)性，所有運動訓(xùn)練均安排在晚上6點之后的固定時間段進行（見表1）。

1.2 行為學(xué)實驗程序

實驗前一天將T組和C組大鼠分別放入水中自由游泳2 min，使其熟悉水迷宮環(huán)境。測試程序主要包括定位航行實驗和空間搜索實驗兩個部分。平臺設(shè)置在第一象限內(nèi)。記錄大鼠自入水至找到平臺四肢爬上平臺所需的時間，作為逃避潛伏期。

1.2.1 定位航行實驗 實驗歷時5天，每天分上、下午各一個訓(xùn)練程序，每只大鼠在一個程序內(nèi)訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時將每只大鼠分別從4個象限面向池壁放入水中，計算機監(jiān)測并記錄大鼠從入水開始尋找至找到并爬上平臺所需時間（潛伏期），如果大鼠2 min內(nèi)未找到平臺，需將其牽引到平臺，并停留30～60 s，這時潛伏期記為2 min，每次訓(xùn)練間隔60 s，共訓(xùn)練10個程序。

1.2.2 空間搜索實驗 在上述訓(xùn)練結(jié)束后拆除平臺，然后選平臺相對象限為入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄2 min內(nèi)大鼠在各象限區(qū)域內(nèi)游泳的時間占總時間的百分比；記錄它們穿越原有平臺的次數(shù)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 樣本采集 將動物斷頸椎處死后，取頭，打開顱腔，取雙側(cè)海馬組織，所有操作均在冰上進行，將取出的海馬置液氮速凍后，－80℃保存，待測。取材過程均由固定人員操作。

1.3.2 總RNA提取 取凍存海馬放在手動玻璃勻漿器中，加1 mmLTrizol，充分勻漿（放在碎冰上操作），采用Trizol法提總RNA，然后用石英比色皿和酶標(biāo)儀檢測OD260/OD280比值，DEPC水做空白調(diào)零，再用DEPC水將RNA樣品按一定比例稀釋?；靹蚝笤?50～310 nm波長之間掃描樣品的動態(tài)吸收譜。計算OD260/OD280比值，選取比值接近2.0的RNA（每組選取8個質(zhì)量最優(yōu)的）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的組分（反應(yīng)總體積為20 μL體系）：OligoDT（1 μL），DdH20（2.5 μL），RNA樣品（9.5 μL，OD260=1相當(dāng)于RNA濃度40 μg/mL，RNA樣品濃度（μg/mL）=[OD260－OD310]×稀釋倍數(shù)×40），RT緩沖液（4 μL），dNTP混合液（1 μL），RNA酶抑制劑（1 μL），M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（1 μL）。

1.3.4 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系（總體積20 μL）：2×SYBR green PCR MasterMix（10 μL）包含下列成分：SYBR green I、HotStart Taq DNA Polymerase、Reaction Buffer、dNTP、Mg2+，預(yù)混液包含下列成分：Forward Primer（10 μM）（1μL）、Reverse Primer（10 μM）（1 μL）、RNase free water（4 μL），cDNA模板（4 μL）。

以β－actin作為內(nèi)參，引物序列為：CREB：F 5'ATTTCAT TACAAAGGGCGCAAA3'R5'ATATATGCAAATGGCTGGTCCC3'，β－actin：F 5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3'R 5'ATACTCCTGCT TGCTGATCC3'。以上引物序列查自NCBI數(shù)據(jù)庫，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

溫度循環(huán)參數(shù)：Step 1：預(yù)變性[95℃，60 s]；Step 2：[95℃，15 s；61℃，25 s；72℃，45 s，收集熒光]×40個循環(huán)；Step 3：建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，再變性[95℃，60 s]，退火[55℃，45 s]，然后從55℃緩慢加熱到95℃，15 s；每1℃收集熒光。

反應(yīng)結(jié)果：熔解曲線只顯示一個主波峰，表明PCR擴增的特異性較高，符合熒光定量PCR的技術(shù)要求。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β－actin基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2－ΔCt計算各樣品目的基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct'（樣品的Ct值）－Ct（β－actin的Ct值）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS15.0進行統(tǒng)計學(xué)分析計算，數(shù)據(jù)處理使用獨立樣本T檢驗，其中P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié) 果

2.1 定位航行實驗結(jié)果

如圖1所示，在迷宮測試的第一天，兩組大鼠的潛伏期不存在顯著性差異，但T組潛伏期的平均值明顯小于C組，從第二天開始兩組的潛伏期存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

2.2 空間搜索實驗結(jié)果

如圖2和圖3所示，分析大鼠在第6天的空間搜索實驗數(shù)據(jù)得出，在拆除平臺后，大鼠在2 min內(nèi)均表現(xiàn)出對原有平臺的記憶，一進入水中就表現(xiàn)出對原有平臺的搜索。T組大鼠穿越站臺位置的次數(shù)多于C組，但沒有顯著性差異；T組大鼠在第一象限時間百分比大于C組，但差異不顯著。

2.3 海馬CREB mRNA測定結(jié)果

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以看出，8周有氧跑臺訓(xùn)練之后，T組大鼠海馬CREB mRNA表達的平均值都顯著高于C組（P＜0.05），T組上調(diào)28.8%。

3 討 論

Radak等對幼年和老年大鼠進行了為期9周的游泳訓(xùn)練，通過主動逃避實驗測試發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的游泳訓(xùn)練能提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過7周自愿跑輪運動的運動組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的獲得顯著優(yōu)于安靜組[5]。我們的實驗結(jié)果顯示，在定位航行實驗中，兩組大鼠潛伏期的變化差異顯著：從實驗的第一天開始，T組大鼠的潛伏期就小于C組，第二天起，T組大鼠潛伏期的測試成績與C組比較呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。這表明T組大鼠的學(xué)習(xí)能力明顯好于C組，學(xué)習(xí)記憶能力提高的速度也明顯高于C組?？臻g搜索實驗是在撤去平臺下大鼠進行尋找平臺的實驗，與前5天的定位航行實驗相比，環(huán)境發(fā)生了變化，大鼠在尋找平臺時會受到環(huán)境的影響，因此雖然T組在穿越平臺次數(shù)以及第一象限游泳時間百分比都大于C組，但不具有顯著性差異，這表明T組對原有平臺空間位置的記憶保持能力與C組差異不大但還是要好于C組。因此，綜合定位航行實驗及空間搜索實驗的所有數(shù)據(jù)仍然可以說明長期有規(guī)律的有氧運動訓(xùn)練可以使學(xué)習(xí)記憶能力得到提高。

CREB[6]是存在于真核生物細胞核內(nèi)的組成性轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞內(nèi)多條信號傳遞途徑，把細胞膜的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_水平的變化，具有調(diào)節(jié)精子生成、晝夜節(jié)律、學(xué)習(xí)記憶等功能。研究表明，當(dāng)在學(xué)習(xí)記憶行為訓(xùn)練前向大鼠海馬內(nèi)注入CREB反義寡核苷酸而阻止CREB的作用，可導(dǎo)致其Morris水迷宮的空間學(xué)習(xí)缺損[7]；而訓(xùn)練前雙側(cè)穹窿海馬傘被切斷的大鼠，也可因海馬CREB磷酸化水平不能升高而使逃避性記憶受損[8]。最近報道，老年大鼠海馬CA1區(qū)CREB磷酸化水平下降[9]，這表明CREB參與到與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力下降的機制。由此可見，CREB的活化在學(xué)習(xí)和記憶的形成過程起到重要的作用，是記憶儲存不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子。那么CREB是通過怎樣的作用途徑促進學(xué)習(xí)記憶的呢？有報道認為磷酸化的CREB促進了CRE序列的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)位于其下游的大量基因如即刻早基因（c－fos等）和編碼突觸素Ⅰ、CaMKⅡ[10]、BDNF等基因的轉(zhuǎn)錄[11]，形成新的突觸聯(lián)系，從而使獲得的信息得以長期儲存。

實驗結(jié)果顯示，8周有氧跑臺訓(xùn)練增強了T組大鼠海馬CREBmRNA的表達水平，其表達量的平均值顯著高于C組（P＜0.05），上調(diào)28.8%。這提示，長期適宜的運動訓(xùn)練可以促進腦內(nèi)CREBmRNA的表達，進而有益于學(xué)習(xí)記憶能力的增強。馬強等人采用實時熒光定量PCR法對28只成年雄性Wistar大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，進行4周自愿跑輪運動的運動組大鼠，海馬內(nèi)CREBmRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）[12]。R Molteni等人研究發(fā)現(xiàn)，進行1個月和2個月跑輪訓(xùn)練能使高脂進食（HF）大鼠海馬pCREBmRNA顯著增加，并逆轉(zhuǎn)由HF所引起的記憶缺陷[13]。本實驗表明，8周有氧跑臺訓(xùn)練促使大鼠腦內(nèi)海馬CREBmRNA表達量增加，增強大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

4小 結(jié)

本研究結(jié)果顯示，8周有氧跑臺訓(xùn)練可以提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并顯著性地增強大鼠海馬內(nèi)CREBmRNA的表達。由此我們可以推測，運動引起的大鼠海馬內(nèi)CREBmRNA表達的增加可能是運動促進學(xué)習(xí)記憶能力機制的重要環(huán)節(jié)。

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Effects of Treadmill Training on Rats'Learning and Memory and CREB mRNA Expression in Hippocampus

YU Haizhen1，F(xiàn)AN Haixia2，XU Bo3
（1.Shanghai Aurora Vocational College，Shanghai 201908，China；2.School of Higher Vocational Education，Shanghai University of Engineering Science，Shanghai 200437，China；3.School of PE and Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China）

Aims：To explore the effects of 8－week aerobic treadmill training on learning and memory and CREBmRNA expression in hippocampus of rats.Materials&methods：Healthy male Spargue－Dawley rats were selected and assigned randomly into two groups：controlled（C，n=10），trained（T，n=10）.The rats of trained group took part in running training for 8 weeks，5 times every week.All groups participate in the Morris Water Maze tested for 6 days during the 8th week.The expression level of CREBmRNA in hippocampus of all rats are inspected by real－time fluorescence quantitative PCR.Results：8－week aerobic treadmill training can enhance the abilities of learning and memory of T group of rats in MWM and significantly up－regulate the expression of CREBmRNA（28.8%）in hippocampus.Conclusion：8－week aerobic treadmill training can improve the abilities of learning and memory of rats，which may relate with the high expression of CREBmRNA in hippocampus of rats.

aerobic treadmill training；learning and memory；hippocampus；CREB

G 804.7

A

1005-0000（2011）06-0539-03

2011-09-16；

2011-10-25；錄用日期：2011-10-27

于海珍（1978-），女，江蘇邳州人，講師，研究方向為體育運動與身心健康。

1.上海震旦職業(yè)學(xué)院體育部，上海201908；2.上海工程技術(shù)大學(xué)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海200437；3.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241。

表1 動物訓(xùn)練模型
Tab.1 The training model of the rats

注：8周有氧跑臺訓(xùn)練每周5次；水迷宮實驗歷時6天，前5天每天分上下午各一個訓(xùn)練程序，每個程序4次，第6天進行記憶能力的測試。

飼養(yǎng)時間 第1～3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周跑速/km·h-10.8 0.8 0.9 0.9 0.9 0.9時間/m·d-130 40 45 50 60 60坡度/° 0 5 5 5 5 5水迷宮/t·d-18