石 磊，曹若男，樊小力，陳龍偉

●成果報(bào)告

不同頻率正弦波振動(dòng)對(duì)大鼠廢用性肌萎縮的對(duì)抗作用

石 磊1，曹若男2，樊小力3，陳龍偉1

目的：探討正弦波振動(dòng)（HFV）對(duì)制動(dòng)大鼠肌肉萎縮的對(duì)抗作用。方法：以大鼠后肢制動(dòng)為廢用模型，對(duì)振動(dòng)組大鼠施以不同頻率的HFV，觀察大鼠比目魚?。⊿OL）濕重體重比、肌纖維橫截面積、梭外肌纖維構(gòu)成比以及梭內(nèi)肌纖維肌球蛋白重鏈（MHC）的表達(dá)的變化。結(jié)果：（1）制動(dòng)14 d后，SOL濕重體重比、肌纖維橫截面積以及梭外?、裥图±w維的構(gòu)成比明顯下降，Ⅱ型肌纖維的構(gòu)成比明顯增加，梭內(nèi)肌纖維MHC的表達(dá)有所增強(qiáng)；（2）施加HFV后，SOL濕重體重比、肌纖維橫截面積和Ⅰ型肌纖維的構(gòu)成比明顯上升，Ⅱ型肌纖維的構(gòu)成比明顯下降，梭內(nèi)肌纖維MHC的表達(dá)正常。結(jié)論：HFV可對(duì)抗廢用后SOLⅠ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化和梭內(nèi)肌MHC表達(dá)有增強(qiáng)的趨勢(shì)，且以200 Hz HFV組最為顯著。

高頻正弦波振動(dòng)；肌球蛋白重鏈；肌梭

運(yùn)動(dòng)減退、制動(dòng)或肌肉去負(fù)荷，均可使骨骼肌出現(xiàn)明顯的廢用性萎縮[1-2]，肌纖維的重量及橫截面積均發(fā)生明顯改變，這種改變對(duì)人體的技能提高和恢復(fù)效率乃至運(yùn)動(dòng)壽命會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[3-6]。因此，隨著我國(guó)體育事業(yè)的發(fā)展，尋找和制定更為安全有效的防護(hù)措施具有重要意義。

肌梭的傳入放電減少是廢用性肌萎縮發(fā)生的重要原因之一[7-8]。因此我們推論，如某種方法可以使肌梭的傳入增強(qiáng)，則在理論上能夠?qū)箯U用性肌萎縮。研究表明，高頻正弦波振動(dòng)（HFV）可以選擇性地興奮肌梭[9-12]。為此，我們以大鼠后肢伸長(zhǎng)位制動(dòng)為廢用動(dòng)物模型，采用短時(shí)間歇式振動(dòng)的方法，結(jié)合免疫組化染色法檢測(cè)，觀察50 Hz、200 Hz和400 Hz HFV對(duì)制動(dòng)大鼠比目魚?。⊿OL）濕重體重比、肌纖維橫截面積、梭外肌纖維的構(gòu)成比以及梭內(nèi)肌纖維MHC表達(dá)的影響，探討其對(duì)廢用性肌萎縮的對(duì)抗作用，為尋找預(yù)防和治療廢用性肌萎縮的有效措施提供資料。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

將健康雌性Sprague-Dawley品系大鼠按體重配對(duì)原則分為5組（西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重為230～240 g，每組7只動(dòng)物）：正常同步對(duì)照組（CON），制動(dòng)（IMM）14天組，制動(dòng)+50 Hz振動(dòng)（IMM+50 Hz HFV）14天組，制動(dòng)+200 Hz振動(dòng)（IMM+100 Hz HFV）14天組，制動(dòng)+400 Hz振動(dòng)（IMM+200 Hz HFV）14天組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[13]。

1.2 制動(dòng)動(dòng)物模型

應(yīng)用傳統(tǒng)模型并加以改進(jìn)[14]：將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，在大鼠左后肢的彎曲部位（神經(jīng)和血管較為密集且易受壓位置）墊以棉層，最終用石膏繃帶包扎動(dòng)物后肢，將其固定在踝關(guān)節(jié)背伸（約45°）而膝關(guān)節(jié)伸展（約180°）位，使SOL處于伸長(zhǎng)位。

1.3 振動(dòng)方法

在SOL肌腹部位采取短時(shí)多次的間歇式振動(dòng)方法進(jìn)行振動(dòng)（50 Hz、200 Hz和400 Hz，300 μm，14天）。振動(dòng)刺激詳盡環(huán)節(jié)如下：每振動(dòng)1 min后間歇1 min，重復(fù)4次后間歇2 min，此為一個(gè)振動(dòng)周期，一個(gè)振動(dòng)點(diǎn)每周期振動(dòng)時(shí)間總計(jì)4 min（不包括間歇時(shí)間），每次重復(fù)振動(dòng)3個(gè)周期，每天進(jìn)行4次振動(dòng)。

1.4 MHC表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè)

將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，稱體重后經(jīng)升主動(dòng)脈行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL，稱重并剪修肌肉（以100 g體重標(biāo)化計(jì)算比目魚肌濕重體重比，MWW/BW），然后浸于多聚甲醛固定液（40 g/L，4℃）中過(guò)夜，以垂直位行石蠟包埋。石蠟切片以接近肌腹的橫截面（厚度為5 μm）為優(yōu)選。研究采取抗快縮型MHC抗體（一抗為MY－32，購(gòu)自Sigma公司；二抗為抗小鼠IgG，購(gòu)自Vector公司），參照傳統(tǒng)ABC法進(jìn)行免疫組化染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 Image－Pro PLUS圖象分析系統(tǒng)（MEDIA CYBERNETICS）對(duì)各型肌纖維的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，測(cè)定每個(gè)視野內(nèi)各型肌纖維數(shù)，并計(jì)算各型肌纖維的構(gòu)成比和肌纖維的橫截面積（CSA），求出每組動(dòng)物的均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件中的單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，取P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的界值。

2結(jié) 果

2.1 HFV對(duì)制動(dòng)大鼠梭外肌纖維MHC表達(dá)及顯微結(jié)構(gòu)的影響

大鼠行制動(dòng)實(shí)驗(yàn)14天后，梭外肌快縮型MHC的表達(dá)與CON組相比有所增強(qiáng)，SOL肌纖維的構(gòu)成比有明顯改變，Ⅰ型肌纖維（慢?。┑臉?gòu)成比減少，由86%減少到70%，Ⅱ型肌纖維（快?。┑臉?gòu)成比增加，由14%增加到30%，IMM組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比均有所下降，與CON組對(duì)比有顯著性差異（P＜0.05）。這表明制動(dòng)使SOL有了慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。IMM組SOL梭外肌纖維結(jié)構(gòu)特征：肌束狀結(jié)構(gòu)紊亂，肌纖維間隙加大，肌內(nèi)膜下結(jié)締組織大量增生，有呈病灶性表現(xiàn)的傾向。振動(dòng)組與IMM組的染色結(jié)果相比，Ⅰ型肌纖維的構(gòu)成比明顯上升，同時(shí)Ⅱ型肌纖維的構(gòu)成比明顯下降（P＜0.05），其中以IMM+200 Hz HFV組的變化最為明顯。振動(dòng)組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比與CON組對(duì)比均有所下降，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05，見表1）。結(jié)果提示，在制動(dòng)期間對(duì)大鼠施加HFV可以對(duì)抗因制動(dòng)而引起的梭外慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。

表1 HFV對(duì)模擬廢用大鼠SOL梭外肌纖維的對(duì)抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

表1 HFV對(duì)模擬廢用大鼠SOL梭外肌纖維的對(duì)抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

注：*P＜0.05，與CON組相比；#P＜0.05，與IMM相比。

組別 MWW/BW CSAⅠ/μm2 CSAⅡ/μm2 Prcentage ofⅠfibers/% Prcentage ofⅡfibers/% CON 43.78±4.25 2 587.01±91.23 1 793.46±89.91 13.69±2.13 86.31±2.67 IMM 3194±3.07* 1 904.57±81.04* 1 387.43±92.65* 30.48±3.14a 69.52±3.01a IMM+50 HzHFV 38.91±2.86# 2 289.32±83.57# 1 504.47±84.08# 21.49±2.87# 78.51±2.98# IMM+200 Hz HFV 41.65±4.13# 2 461.14±90.78# 1 639.25±89.41# 16.93±2.91# 83.07±2.87# IMM+400 Hz HFV 39.04±5.12# 2 354.59±87.63# 1 594.56±84.38# 18.16±2.93# 81.84±2.72#

2.2 HFV對(duì)制動(dòng)大鼠梭內(nèi)肌纖維MHC表達(dá)及顯微結(jié)構(gòu)的影響

在CON組SOL肌梭的染色結(jié)果可以觀察到：核袋Ⅰ纖維內(nèi)無(wú)著色沉淀（陰性肌纖維）；核袋Ⅱ纖維多無(wú)著色沉淀（陰性肌纖維），少數(shù)有淺褐色沉淀（弱陽(yáng)性肌纖維）；而核鏈纖維內(nèi)則出現(xiàn)棕色沉淀（陽(yáng)性肌纖維）。CON組SOL肌梭結(jié)構(gòu)特征：被囊膜完整，軸周間隙結(jié)構(gòu)正常，核袋和核鏈纖維區(qū)分明顯。在IMM組SOL肌梭的染色結(jié)果可以觀察到：核袋Ⅰ纖維內(nèi)依然無(wú)著色沉淀（陰性肌纖維）；核袋Ⅱ纖維多有褐色沉淀（陽(yáng)性肌纖維）；而核鏈纖維內(nèi)則出現(xiàn)深棕色沉淀（強(qiáng)陽(yáng)性肌纖維）。這表明制動(dòng)使梭內(nèi)肌呈現(xiàn)了慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。IMM組大鼠SOL肌梭結(jié)構(gòu)特征：梭內(nèi)肌破壞嚴(yán)重，部分肌膜溶解消失，軸周間隙增寬，內(nèi)囊壁部分腫脹溶解。振動(dòng)組大鼠梭內(nèi)肌纖維著色及顯微結(jié)構(gòu)的變化近于正常而無(wú)顯著的病灶傾向（見圖1）。結(jié)果提示，在制動(dòng)期間對(duì)大鼠施加HFV可以對(duì)抗因制動(dòng)而引起的梭內(nèi)慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。

3 討 論

MHC是骨骼肌纖維中最重要的肌原纖維蛋白之一，含有與肌肉收縮速度有關(guān)的酶活性，維持肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。骨骼肌纖維至少表達(dá)6種表型的MHC：MHCⅠ/beta cardiac MHC；MHCⅡa；MHCⅡb；MHCⅡd/x；MHC embryonic；MHC fetal/ neonatal，其表型的變化必然會(huì)影響肌纖維的代謝和功能特性。本實(shí)驗(yàn)選用以兔的快肌纖維作為免疫源而得到的MHC抗體僅檢測(cè)快肌MHC的一個(gè)表位，可以同梭內(nèi)、外肌纖維中快肌纖維的所有亞型發(fā)生免疫反應(yīng)，同慢肌則不發(fā)生反應(yīng)。研究表明，在廢用狀態(tài)下，SOL（典型慢?。?huì)發(fā)生明顯的萎縮，慢氧化型纖維數(shù)量明顯減少，而中間型、快氧化型和酵解型纖維數(shù)量卻增加。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期的文獻(xiàn)報(bào)道一致：廢用14天后，SOL梭外肌纖維MHC的表達(dá)水平和表型發(fā)生了改變，Ⅰ型肌纖維的構(gòu)成比明顯減少，Ⅱ型肌纖維的構(gòu)成比明顯增加，出現(xiàn)了Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

肌梭與骨骼肌在發(fā)生學(xué)上有著相同的起源與血供來(lái)源，與梭外肌為同一反射弧的不同部分。核袋Ⅰ纖維的代謝特點(diǎn)類似慢肌，而核袋Ⅱ纖維和核鏈纖維則類似快肌。國(guó)外學(xué)者曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌肉制動(dòng)不但可引起肌肉本體感受器的傳入沖動(dòng)減少，而且肌梭的核袋和核鏈纖維的橫截面積也會(huì)相應(yīng)減少[15-18]。本研究結(jié)果顯示：廢用14天后，SOL肌梭的核袋Ⅰ纖維中MHC的表達(dá)仍呈陰性，核袋Ⅱ纖維出現(xiàn)由陰性向陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化，核鏈纖維MHC的表達(dá)有所增強(qiáng)，這表明制動(dòng)使梭內(nèi)肌呈現(xiàn)了慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。

將HFV作為外界機(jī)械刺激可以提高肌梭的興奮性，使肌梭的傳入放電活動(dòng)增強(qiáng)，因此HFV常作為一種肌梭敏感性的研究手段，但其作為廢用性肌萎縮的對(duì)抗措施卻少見研究。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)[19]，對(duì)大鼠跟腱施以120 Hz的HFV，可以明顯地對(duì)抗大鼠失重性肌萎縮的癥狀。另有研究證實(shí)，振動(dòng)動(dòng)物的肌肉可以使其初級(jí)傳入末梢的興奮性增強(qiáng)，而且還能夠增強(qiáng)其某些次級(jí)傳入末梢的興奮性，而振動(dòng)肌腱則僅限于對(duì)初級(jí)傳入末梢興奮性的增強(qiáng)。因此，考慮到能夠更大程度地興奮肌梭，我們所采用的振動(dòng)部位與前者有所不同，即由肌腱轉(zhuǎn)為了肌腹。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，這種肌肉振動(dòng)方法對(duì)制動(dòng)引起的廢用性肌萎縮的具有一定的對(duì)抗作用，可使肌梭的傳入沖動(dòng)增加，可以減緩制動(dòng)大鼠SOL肌纖維橫截面積和濕重體重比的減少趨勢(shì)。本次MHC染色結(jié)果顯示，在大鼠制動(dòng)期間給予HFV后，SOL梭外肌Ⅰ型肌纖維的構(gòu)成比明顯上升，同時(shí)Ⅱ型肌纖維的構(gòu)成比明顯下降，其中以IMM+200 Hz HFV組的變化最為明顯。振動(dòng)組SOL梭內(nèi)肌纖維中MHC表達(dá)及顯微結(jié)構(gòu)的改變均不明顯，接近于正常大鼠。結(jié)果提示，在制動(dòng)期間對(duì)大鼠施加HFV可以有效地對(duì)抗因制動(dòng)而引起的梭內(nèi)、外慢肌纖維向快肌纖維的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，這與前期的研究結(jié)果是一致的；而相對(duì)于50 Hz和400 Hz的HFV，肌梭對(duì)于200 Hz的振動(dòng)可能更為敏感。

從以上方面分析，我們認(rèn)為，HFV對(duì)于廢用性肌萎縮具有對(duì)抗作用，根本原因是由于HFV對(duì)肌梭興奮性的誘發(fā)作用。推測(cè)其機(jī)制為：HFV誘使肌梭的Ia類和Ⅱ類傳入纖維的興奮性增強(qiáng)，加大了肌梭傳向中樞的傳入沖動(dòng)總量，通過(guò)γ和α神經(jīng)活動(dòng)，強(qiáng)化了肌肉運(yùn)動(dòng)單位的參與程度，增大了骨骼肌活動(dòng)的量與強(qiáng)度，改善了梭外肌的代謝環(huán)境，從而維持了肌肉的正常結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉萎縮的對(duì)抗作用。本研究發(fā)現(xiàn)HFV可對(duì)抗廢用后SOLⅠ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化和梭內(nèi)肌MHC表達(dá)有增強(qiáng)的趨勢(shì)，且以200 Hz HFV組最為顯著。HFV作為一種對(duì)抗廢用性肌萎縮的有效措施提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Antagonistic Effects of Different Frequency Sinusoidal Vibration Given To Disused Muscle Atrophy in Rats

SHI Lei1，CAO Ruonan2，F(xiàn)AN Xiaoli3，CHEN Longwei1
（1.Dept.of PE，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China；2.School of Foreign Languages，Northwest University，Xi'an 710069，China；3.Dept.of Physiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China）

Objective：To study the antagonistic effects of different frequency sinusoidal vibration given to disused muscle atrophy in rats under immobilization.Methods：The rats were made into models of disused muscles through the immobilization in their hindlimbs.HFV were applied to the immobilized soleus muscles in the vibration group.The ratio of muscle wet weight to body weight of the soleus muscles，the cross-sectional area，the constituent ratio of skeletal muscle fibers and changes of expression of MHC in intrafusal and extrafusal fibers were detected.Results：①After the 14-day immobilization period，the SOL fibers showed an evident shift toward a decreased percentage of fibers typeⅠ，but an increased percentage of typeⅡ.The expression of MHC in muscle spindle was increased.②Compared with the immobilization group，the SOL fibers in the vibration group showed an evident shift toward a increased percentage of fibers typeⅠ，but an decreased percentage of typeⅡ.The change of expression of MHC in muscle spindle was unconspicuous.Conclusion：HFV was effective in antagonizing the transform of typeⅠtoward typeⅡand the increased expression of MHC in muscle spindle in immobilization rats.The change was the most evident in 200Hz HFV group.

high frequency sinusoidal vibration；myosin heavy chain；muscle spindle

G 804.2

A

1005-0000（2011）06-0482-03

2011-08-30；

2011-10-21；錄用日期：2011-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30901583）；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2009KW-20）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：xjj20100181）

石 磊（1974-），男，山東泰安人，博士，教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué)。

1.西安交通大學(xué)體育部，陜西西安710049；2.西北大學(xué)外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，陜西西安710069；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西西安710061。