王勇，傅博，朱榮39

（1.濰坊學院 體育學院，山東 濰坊 261061；2.遼寧省足球運動管理中心，遼寧 沈陽 110081；3.溫州醫(yī)學院 體育科學學院，浙江 溫州 325035）

急性力竭運動對青少年田徑運動員血漿游離DNA的影響

王勇1，傅博2，朱榮329

（1.濰坊學院 體育學院，山東 濰坊 261061；2.遼寧省足球運動管理中心，遼寧 沈陽 110081；3.溫州醫(yī)學院 體育科學學院，浙江 溫州 325035）

為探討急性力竭運動對青少年田徑運動員血漿游離DNA(cf-DNA)的影響，尋找運動員機能監(jiān)控的新標記物。安排16名青少年田徑運動員在電動跑臺上進行一次急性遞增負荷力竭運動，于運動前、運動后即刻、運動后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h分別測定紅細胞壓積(HCT)、cf-DNA、血漿丙二醛(MDA)、肌酸激酶(CK)和肌紅蛋白(Mb)。用心率表監(jiān)控運動過程并記錄運動時間和心率，推算訓練沖量(TRIMPS)。結果顯示：HCT在所有監(jiān)測時間點均無顯著性變化(P>0.05)；cf-DNA在運動后即刻顯著性升高(P<0.01)，30 min達峰值(P<0.01)，4 h后降至安靜水平(P>0.05)；血漿MDA、CK和Mb在運動后即刻均顯著性升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，并一直持續(xù)到運動后24 h(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。TRIMPS與運動后15 min和30 min時cf-DNA水平呈顯著正相關(分別為r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。結果說明：cf-DNA是組織損傷早期標志物，可作為運動員機能監(jiān)控的新指標。

運動生物化學；力竭運動；血漿游離DNA；機能監(jiān)控；運動員

機能監(jiān)控是運動訓練的關鍵組成部分，是運動員取得良好訓練效果和優(yōu)異比賽成績的重要保障?？蒲腥藛T和教練員不斷探索新的方法和標記物，以便更科學地監(jiān)控運動訓練[1-2]。近年來，由于PCR及其相關分子生物學技術的發(fā)展，可在體液中定量并分析含量極少的游離DNA，稱為循環(huán)DNA(circulation DNA)，即存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中的細胞外DNA，其中存在于血漿中的游離 DNA稱為血漿游離DNA(cell-free plasma DNA，cf-DNA)[3-4]。凋亡以及壞死細胞的DNA釋放入血即形成cf-DNA，它已成為臨床醫(yī)學中多種疾病(包括腫瘤、創(chuàng)傷、妊娠相關疾病、感染性疾病、心肌梗死等)早期診斷、病情監(jiān)測、療效及預后評估的一種重要的分子標志物[3-4]。由于cf-DNA是一項無創(chuàng)性檢測指標，因此有望在運動醫(yī)學中得到應用。本研究旨在探討一次急性力竭運動對青少年田徑運動員cf-DNA的影響，同時將其與傳統(tǒng)機能監(jiān)控指標丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)進行比較，以期尋找運動員機能監(jiān)控的新的敏感標記物。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

16名溫州體育運動學校的男子田徑運動員自愿參加本實驗，年齡(11.6±2.6)歲，身高(1.74±0.14) cm，體重(68.6±5.4) kg，訓練年限(4.1±0.8)年。所有運動員身體健康，無心血管疾病、急慢性感染、骨關節(jié)疾病及其他疾病史，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

1.2 運動方案

實驗前72 h內受試者均未進行過劇烈運動，實驗前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹采靜脈血5 mL后休息15 min，然后在電動跑臺上進行遞增負荷實驗，起始負荷為5 km/h，持續(xù)3 min，之后每3 min遞增1 km/h，直至力竭。整個過程用遙測心率表(Polar，S810，芬蘭)記錄心率和運動時間。運動后即刻以及運動后(休息) 15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h靜脈采血5 mL，EDTA抗凝。

1.3 運動負荷的量化——訓練沖量(TRIMPS training impulses)

采用 Banister等[5-6]提出的計算運動沖量的方法，公式為：運動沖量=D×X×K。其中，D=運動時間(min)，X=訓練強度=(運動時平均心率－安靜心率)/(最高心率－安靜心率)，K=訓練強度加權指數(shù)=eαx(e為歐拉常數(shù)，是自然對數(shù)的底≈2.718 28；α=1.92)。

運動時間、安靜心率、運動時平均心率和最高心率均可通過心率表獲得。

1.4 MDA、CK和Mb的測定

取300 μL全血，測定HCT(紅細胞壓積)(全血分析儀，MICROS60，美國)；其余全血在低溫下(4 ℃)離心 15 min(3 000 r/min)，取血漿測試各生化指標。MDA、CK和Mb使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)并嚴格按照操作說明進行，測試儀器：MD-100半自動生化分析儀(日本)。

1.5 cf-DNA的測定[7-8]

1)血漿DNA提取和純化。

取離心后的血漿400 μL，嚴格按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)的操作步驟進行cf-DNA的提取，然后用50 μL雙蒸水(不含RNA酶和DNA酶)進行洗脫。

2)cf-DNA定量分析。

取10 μL cf-DNA置于透明載板，與1︰3 000熒光染料SYBR green I等比例稀釋并充分混勻后置于紫外及可見光成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)中，在激發(fā)光波長為345 nm、吸收波長500 nm條件下，讀取其發(fā)光強度。將檢測所得不同樣本DNA的發(fā)光強度代入根據(jù)標準含量DNA的發(fā)光強度所作的回歸方程中，分別計算相應的DNA質量濃度。如果樣本發(fā)光強度超過標準DNA發(fā)光強度范圍，則將樣本稀釋后再進行定量檢測，直到所測值在標準質量濃度范圍內。每次對同一血漿樣本檢測3次，取其平均值，單位為pg/μL。

1.6 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，指標各時間點的比較采用重復測量的方差分析，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗。對TRIMPS和cf-DNA進行簡單相關分析并計算 Pearson相關系數(shù)?。P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著水平。用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果及分析

2.1 各指標的時程變化

HCT在所有監(jiān)測時間點均無顯著性變化(P>0.05)(圖 1)，因此，運動干預與取血測試并沒有造成機體的明顯血漿丟失和血液濃縮，所有濃度指標均可較為準確反映其實際變化。

cf-DNA在運動后即刻顯著性升高(P<0.01)，30 min達峰值(P<0.01)，隨后逐漸下降，運動后3 h仍高于基礎水平(P<0.01)，運動后4 h降至基礎值(P>0.05)，并一直維持到24 h(P>0.05)(圖2)。

MDA在運動后即刻明顯升高(P<0.05)，隨后繼續(xù)升高，并在運動后24 h出現(xiàn)峰值(P<0.01)(圖3)。

CK的變化與 MDA相似，即運動后即刻升高(P<0.01)，運動后24 h出現(xiàn)峰值(P<0.05)(圖4)。

Mb在運動后即刻升高(P<0.01)，運動后4 h出現(xiàn)峰值(P<0.05)，隨后逐漸下降，但在運動后24 h仍高于基礎水平(P<0.01)(圖5)。

圖1 HCT在運動前后的時程變化

圖2 cf-DNA在運動前后的時程變化

圖3 MDA在運動前后的時程變化

圖4 CK在運動前后的時程變化

圖5 Mb在運動前后的時程變化

2.2 相關分析

相關分析顯示，TRIMPS與運動后15 min和30 min時cf-DNA水平呈顯著正相關(分別為r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。運動之前與其他的時間點相關均無顯著性。

3 討論

劇烈運動時肌肉暫時性缺血，運動后恢復期血流再灌注(缺血-再灌注)，可出現(xiàn)細胞內鈣超載、炎癥細胞浸潤以及自由基產生增多，繼而發(fā)生DNA的氧化損傷和降解[9-10]。同時，運動還通過機械作用造成肌纖維的損傷，表現(xiàn)為肌痛、無力、血清肌肉蛋白升高等。上述代謝機制和機械機制可導致肌細胞的凋亡甚至壞死[11]。本研究中MDA在運動后顯著性升高，證實機體產生自由基增多；運動后CK、Mb升高，表明肌細胞受到運動誘導的缺血再灌注損傷使其破壞增加[12]，其原因可能是自由基攻擊DNA、蛋白質和脂質(特別是膜的脂質雙層)，從而產生氧化損傷所致[13]。DNA損傷(核苷酸氧化、雙鏈斷裂或DNA交聯(lián))后“事件”為DNA缺陷修復、凋亡和壞死[14-15]。DNA缺陷修復會造成DNA序列發(fā)生改變，引起代謝紊亂甚至癌癥[16]。非特異性DNA修復酶切除損傷部位并釋放DNA片段[17]，堿基特異性的修復酶切除相應的堿基[18]，這些產物釋放入血形成cf-DNA。

cf-DNA最早發(fā)現(xiàn)于癌癥患者的血循環(huán)中[19]，隨后證實與多種臨床疾患相關聯(lián)。因此，cf-DNA已成為預測和診斷多種疾病的分子標志物。例如，創(chuàng)傷后發(fā)生多器官功能紊亂綜合征的患者往往在創(chuàng)傷發(fā)生 15～30 min后cf-DNA即顯著升高，并持續(xù)數(shù)天；而無創(chuàng)傷并發(fā)癥的患者cf-DNA往往出現(xiàn)較晚、升高幅度較低、持續(xù)時間較短[20]。癌癥患者基因發(fā)生突變，血液中出現(xiàn)相應的突變DNA、癌基因擴增產物以及腫瘤相關的病毒DNA[21]。盡管cf-DNA與疾病關系的具體機制尚不明確，但諸多研究已證實，cf-DNA來自于凋亡或壞死的組織細胞[4]。在本研究中，力竭運動后cf-DNA急劇增加同時伴隨血清CK與Mb升高，提示骨骼肌細胞凋亡、DNA片段的釋放可能是cf-DNA的主要來源，但不是唯一來源。一些研究表明，運動后發(fā)生凋亡的腎小管細胞[22]和白細胞[23]均是cf-DNA的來源。因此，運動后cf-DNA的升高是多種類型細胞凋亡的結果。

cf-DNA在運動后的時程變化規(guī)律罕有報道。Atamaniuk等[23]觀察了一次力量訓練對 cf-DNA的影響，結果發(fā)現(xiàn)訓練后即刻cf-DNA顯著升高，2 h后顯著下降；Fatouros等對17名普通人進行為期12周的力量訓練干預，cf-DNA在訓練后72 h仍高于安靜水平。這可能與不同的研究對象、運動方式、運動周期和測試時間等有關，但上述研究未檢測運動后即刻至運動后2 h這段時間內cf-DNA的變化。

本研究以田徑運動員為受試對象，采用力竭運動模型，運動后的測量時間點較為密集，從而揭示了cf-DNA在力竭運動后的變化規(guī)律。cf-DNA在運動后即刻顯著升高，30 min達峰值，隨后逐漸下降，運動后3 h仍高于基礎水平，運動后4 h降至基礎值，時間上比Atamaniuk等的研究結果稍滯后，可能與本研究所采用的力竭模型有關。cf-DNA在運動后即迅速消除，這與傳統(tǒng)機能監(jiān)控指標MDA、CK和Mb在運動后顯著升高并一直持續(xù)到24 h的時程變化規(guī)律不同，可能與肝臟和腎臟對cf-DNA的快速代謝有關[4]，也可能是降解的 DNA片段從凋亡或壞死細胞釋放入血的機制不同[23]，具體原因尚不清楚。上述現(xiàn)象提示cf-DNA可能是監(jiān)測肌細胞損傷的早期、敏感、特異的預測與監(jiān)控指標。

TRIMPS與cf-DNA正相關，說明cf-DNA除了可用于監(jiān)測身體機能狀態(tài)，還能反映訓練負荷，即負荷越大，cf-DNA水平越高，可能是不同訓練負荷造成機體損傷程度不同所致。Lo等[24]和Rainer等[25]分別證實了創(chuàng)傷與中風患者組織損傷的程度與cf-DNA呈正相關關系，本研究在一定程度上也驗證了上述結論。TRIMPS與運動后 30 min cf-DNA的相關系數(shù)最高(r=0.64)，而且cf-DNA在運動后4 h迅速消退，提示訓練后的測試時間是一個關鍵因素，因此用此指標監(jiān)控訓練負荷時，應在運動后30 min左右取血測定較為合理。

本研究探討了力竭運動后cf-DNA的變化規(guī)律以及與訓練負荷的關系，但仍有諸多問題尚未解決。今后的研究需要進一步探討運動誘導的cf-DNA的細胞來源和具體機制，不同運動方式、不同競技項目以及不同機能狀態(tài)對cf-DNA的影響，揭示cf-DNA對運動反應和適應的規(guī)律，從而為運動員機能監(jiān)控提供敏感、無創(chuàng)的標志物，為運動員取得良好訓練效果和優(yōu)異比賽成績提供科研保障。

cf-DNA是組織的損傷早期標志物，可作為運動員機能監(jiān)控的新指標，但其時程變化規(guī)律不同于MDA、CK和Mb等傳統(tǒng)指標。

[1] 何子紅，胡揚. 體能訓練個性化新指標——基因標記[J]. 中國運動醫(yī)學雜志，2010，29(5)：597-606.

[2] 郭興明，楊勇，肖守中，等. 運動員心功能評估新方法和新指標的研究[J]. 中國應用生理學雜志，2010，26(3)：380-383.

[3] 孫群，王德生. 游離DNA與臨床腫瘤的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述，2010，16(9)：1348-1350.

[4] Saukkonen K，Lakkisto P，Pettila V，et al. Cell-free plasma DNA as a predictor of outcome in severe sepsis and septic shock[J]. Clin Chem，2008，54(6)：1000-1007.

[5] Banister E W，Calvert T W. Planning for future performance：implications for long term training[J]. Can J Appl Sport Sci，1980，5(3)：170-176.

[6] Manzi V，Castagna C，Padua E，et al. Dose-response relationship of autonomic nervous system responses to individualized training impulse in marathon runners[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(6)：H1：733-1740.

[7] 劉麗榮. 上皮性卵巢癌患者血漿中的 cDNA水平變化及意義[J]. 山東醫(yī)藥，2010，50(34)：93-94.

[8] 今毅，鄭暉，韓冰. 循環(huán)DNA定量分析在乳腺癌診斷中的應用[J]. 微循環(huán)學雜志，2007，17(4)：62-63.

[9] Wohlgemuth S E，Seo A Y，Marzetti E，et al. Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging: effects of calorie restriction and life-long exercise[J]. Exp Gerontol，2010，45(2)：138-148.

[10] 張桂忠，姜寧，張勇. 急性運動中骨骼肌線粒體氧化應激機制研究[J]. 內蒙古師范大學學報：自然科學漢文版，2009，38(3)：337-340.

[11] Brancaccio P，Lippi G，Maffulli N. Biochemical markers of muscular damage[J]. Clin Chem Lab Med，2010，48(6)：757-767.

[12] Goodman C，Henry G，Dawson B，et al. Biochemical and ultrastructural indices of muscle damage after a twenty-one kilometre run[J]. Aust J Sci Med Sport，1997，29(4)：95-98.

[13] Guachalla L M，Rudolph K L. ROS induced DNA damage and checkpoint responses：influences on aging?[J]. Cell Cycle，2010，9(20)：4058-4060.

[14] Chevion S，Moran D S，Heled Y，et al. Plasma antioxidant status and cell injury after severe physical exercise[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(9)：5119-5123.

[15] Ogonovszky H，Berkes I，Kumagai S，et al. The effects of moderate-strenuous-and over-training on oxidative stress markers，DNA repair，and memory，in rat brain[J]. Neurochem Int，2005，46(8)：635-640.

[16] Fehrenbach E，Northoff H. Free radicals，exercise，apoptosis，and heat shock proteins[J]. Exerc Immunol Rev，2001，7：66-89.

[17] Kruger K，F(xiàn)rost S，Most E，et al. Exercise affects tissue lymphocyte apoptosis via redox-sensitive and Fas-dependent signaling pathways[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，296(5)：R1518-1527.

[18] Lesher D T，Pommier Y，Stewart L，et al. 8-Oxoguanine rearranges the active site of human topoisomerase I[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(19)：12102-12107.

[19] Leon S A，Shapiro B，Sklaroff D M，et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J]. Cancer Res，1977，37(3)：646-650.

[20] Lam N Y，Rainer T H，Chan L Y，et al. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients[J]. Clin Chem，2003，49(8)：1286-1291.

[21] 楊英俊，陳輝. 循環(huán)DNA的臨床應用[J]. 生命的化學，2009，26(6)：822-825.

[22] Podhorska-Okolow M ， Dziegiel P ，Murawska-Cialowicz E，et al. Exercise-induced apoptosis in renal tubular cells of the rat[J]. Folia Morphol (Warsz)，2004，63(2)：213-216.

[23] Atamaniuk J，Stuhlmeier K M，Vidotto C，et al. Effects of ultra-marathon on circulating DNA and mRNA expression of pro-and anti-apoptotic genes in mononuclear cells[J]. Eur J Appl Physiol，2008，104(4)：711-717.

[24] Lo Y M，Rainer T H，Chan L Y，et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients[J]. Clin Chem，2000，46(3)：319-323.

[25] Rainer T H，Wong L K，Lam W，et al. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients with acute stroke[J]. Clin Chem，2003，49(4)：562-569.

Effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of teenage track and field athletes

WANG Yong1，F(xiàn)U Bo2，ZHU Rong3
（1.School of Physical Education，Weifang University，Weifang 261061，China；2.Liaoning Center of Football Administration，Shenyang 110081，China；3.School of Physical Education，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）

In order to probe into the effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of teenage track and field athletes, and to seek for a new marker for athlete performance monitoring, the authors arranged 16 teenage track and field athletes to do an acute exhaustive exercise on a power treadmill, tested their Hematocrit (HCT), Cf-DNA, plasma malondialdehyde (MDA), creatine kinase (CK) and myoglobin (Mb) respectively before exercising, immediately after exercising, at 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 12 h and 24 h after exercising, monitored the exercising process with a heat rate meter, recorded their exercising times and heart rates, calculated their exercising impulses (TRIMPS), and revealed the following findings: there was no significant change to HCT at all test times (P>0.05); cf-DNA increased significantly immediately after exercising (P<0.01), reached the peak value at 30 min (P<0.01), and lowered to the calm level at 4 h (P>0.05); plasma MDA, CK and Mb increased significantly immediately after exercising (P<0.05, P<0.01, P<0.01), and maintained up to 24 h after exercising (P<0.01, P<0.05, P<0.01); TRIMPS was positively correlative significantly with the cf-DNA level at 15 min and 30 min after exercising (r=0.55, P<0.01 and r=0.64, P<0.05 respectively). The said findings indicated that cf-DNA is an early marker for tissue damage, can be used as a new index for athlete performance monitoring.

sports biochemistry；exhaustive exercise；cell-free plasma DNA；performance monitoring；athlete

王勇（1979-），男，講師，碩士，研究方向：體育教育與健康。通訊作者：朱榮副教授。

G804.7

A

1006-7116(2011)05-0127-05

2011-01-25

浙江省教育廳科研計劃項目(Y201017123)。

·體育社會科學·