張琳，郝選明

（華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510006）

運動性免疫抑制中胸腺IL-7和TGF-β1應(yīng)答性特征

張琳，郝選明

（華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510006）

通過胸腺細(xì)胞因子IL-7和TGF-β1及其mRNA進(jìn)行研究，探討運動性免疫抑制發(fā)生發(fā)展過程中胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制。將128只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為運動組和對照組，運動組進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練6周，每周6次，周日休息，每次30 min。第1周負(fù)荷為10 m·min-1，第2周負(fù)荷為20 m·min-1，此后每周增加5 m·min-1，至6周時達(dá)40 m·min-1。分別于第0、2、4、6周利用ELISA和FQ-RT-PCR技術(shù)測相對安靜狀態(tài)、運動后即刻和運動后3 h IL-7和TGF-β1及其mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：6周遞增負(fù)荷跑臺運動過程中，IL-7和TGF-β1呈現(xiàn)幾乎相反的應(yīng)答性變化：IL-7及mRNA第0周、第2周末運動后明顯降低，恢復(fù)3 h后升高，呈“V”型應(yīng)答曲線；第4周末，運動前后沒有顯著性變化；第6周末，在運動后持續(xù)下降。TGF-β1在各周呈現(xiàn)倒“V”型變化，TGF-β1 mRNA對負(fù)荷初次應(yīng)答時運動前后沒有明顯變化，其它各周呈倒“V”型變化。以上結(jié)果說明運動性免疫抑制發(fā)生發(fā)展中胸腺IL-7下降和TGF-β1升高可能導(dǎo)致胸腺微環(huán)境紊亂，從而影響胸腺細(xì)胞發(fā)育。

運動生物化學(xué)；運動性免疫抑制；白介素-7；轉(zhuǎn)化生長因子-β；胸腺；應(yīng)答性特征

T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育分化是細(xì)胞免疫應(yīng)答所必需的重要過程。胸腺細(xì)胞分化是一個受嚴(yán)格調(diào)控的過程，不僅依賴于早期T細(xì)胞前體與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用，而且細(xì)胞間的相互作用以及細(xì)胞因子在胸腺細(xì)胞分化過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。白介素-7(interleukin-7，IL-7)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是具有生長因子樣作用的細(xì)胞因子，具有調(diào)控多種免疫應(yīng)答的作用[1-2]。IL-7促進(jìn)早期胸腺細(xì)胞的分化和增殖，在胸腺細(xì)胞發(fā)育中起正性調(diào)節(jié)作用[3]。TGF-β超家族對T細(xì)胞的發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用，抑制早期胸腺細(xì)胞的增殖分化[4]。因此，本研究通過觀察SD大鼠6周遞增運動負(fù)荷后，胸腺組織中的生長因子IL-7、TGF-β1的應(yīng)答性變化，探討長期運動對胸腺細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，為運動性免疫抑制的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性SD大鼠128只(購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵監(jiān)證字F2008A002)，隨機(jī)分為實驗組和對照組。實驗組96只進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練，對照組32只，正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運動干預(yù)，分別于第0、2、4、6周末采樣，用于判別大鼠生長對測試指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組各指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異(P>0.05)，表明6周生長對這些指標(biāo)沒有顯著影響。

1.2 運動模型

采用我們通過反復(fù)實驗性探索獲得的運動性免疫抑制的動物模型[5-7]。運動性免疫抑制的建立條件是：模擬運動訓(xùn)練安排，長時間、大強(qiáng)度且負(fù)荷遞增。因此，采用低強(qiáng)度適應(yīng)性運動(10 m/min)訓(xùn)練1周后，負(fù)荷遞增至20 m/min。隨后，每周遞增負(fù)荷增量5 m/min。至第6周，達(dá)到40 m/min，基本達(dá)到大鼠最大負(fù)荷強(qiáng)度。分別在第0、2、4、6周最后一次運動后48 h采樣。采樣日進(jìn)行與上周相同負(fù)荷的跑臺運動，分別在安靜狀態(tài)(A)、運動后即刻(J)和運動后3 h(3 h)無菌取胸腺。

1.3 測試指標(biāo)及方法

ELISA和實時熒光定量RT-PCR分別測定生長因子IL-7、TGF-β1及mRNA表達(dá)水平。ELISA試劑購自武漢華美公司，RNAiso Plus 和SYBR Green I Real time PCR反應(yīng)試劑購自(TaKaRa)大連寶生物公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各周運動負(fù)荷及恢復(fù)過程中IL-7及mRNA的變化

圖1顯示，第0周J組大鼠胸腺組織IL-7及mRNA表達(dá)與A組相比下降(P<0.05)，運動后3 h組恢復(fù)，與A組比較，無顯著性意義(P>0.05)。J組和3 h組在第2、4和6周IL-7質(zhì)量分?jǐn)?shù)和IL-7 mRNA表達(dá)均低于A組(P<0.05或P<0.01)。在第2、4周J組與A組比較均顯著性下降(P<0.01)，3 h組與J組比較上升，但低于A組(P<0.01)。在第6周J組低于A組，且3 h組與J組相比差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 胸腺IL-7及mRNA各周應(yīng)答性變化情況

2.2 各周運動負(fù)荷及恢復(fù)過程中TGF-β1及mRNA的變化

圖2顯示，第0周J組大鼠胸腺組織TGF-β1表達(dá)水平與A組相比上升(P<0.01)，運動后3 h組略高于對照組。第 0周各組 mRNA表達(dá)無顯著性變化(P>0.05)。J組、3 h組在第2、4和6周TGF-β1質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于A組(P<0.05或P<0.01)。在第2周和第4周J組與A組比較均顯著性上升(P<0.01)，3 h組與J組比較下降(P<0.01)，但均高于A組(P<0.01)。在第6周J組、3 h組均高于A組，其中TGF-β1質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無顯著性(P>0.05)，TGF-β1mRNA差異顯著(P<0.01)，J組、3 h組兩組間差異有非常顯著性(P<0.01)。

圖2 胸腺TGF-β1及mRNA各周應(yīng)答性變化情況

3 討論

3.1 運動性免疫抑制發(fā)展中胸腺IL-7的應(yīng)答及調(diào)控機(jī)制

為探討運動性免疫過程中胸腺細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，我們研究了遞增負(fù)荷運動過程中胸腺組織 IL-7及其mRNA的表達(dá)變化。從實驗結(jié)果來看，IL-7及 mRNA在胸腺組織中表達(dá)，且表達(dá)量隨運動負(fù)荷的增加和時間的延長出現(xiàn)應(yīng)答性的波動：IL-7及mRNA第0、2周末運動后明顯降低，恢復(fù)3 h后升高，呈“V”型應(yīng)答曲線；第4周末，運動前后沒有顯著性變化；第6周末，則在運動后持續(xù)下降。總之，IL-7在第4周時雖然沒有繼續(xù)下降，但表現(xiàn)出隨著運動負(fù)荷的增加而逐漸下降，出現(xiàn)下調(diào)趨勢。

IL-7表達(dá)下調(diào)影響了IL-7對細(xì)胞生長信號需求的應(yīng)答能力，而使機(jī)體無法充分利用IL-7的生長調(diào)控信號，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性胸腺細(xì)胞發(fā)育異常以及隨后的成熟淋巴細(xì)胞的失調(diào)控。其可能的機(jī)制是：首先，IL-7是胸腺雙陰性(double-negative，DN)祖細(xì)胞發(fā)育的重要信號，IL-7的下調(diào)直接影響 DN及下游雙陽性(double-positive，DP)、單陽性(single-positive，SP)細(xì)胞的發(fā)育。其次，運動狀態(tài)下，神經(jīng)、內(nèi)分泌以及內(nèi)環(huán)境的改變都會對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同影響，免疫抑制類調(diào)節(jié)物質(zhì)如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素等在運動刺激作用下明顯增加，再加上交感神經(jīng)興奮所產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)，對免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。研究表明，IL-7通過影響細(xì)胞內(nèi)的生長因子水平，保護(hù)T細(xì)胞免受糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子下降以及輻射等誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[8]。第三，F(xiàn)as介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在運動免疫抑制發(fā)展中起了重要的作用，而其中IL-7可能與這一凋亡機(jī)制有關(guān)。IL-7通過上調(diào)Bcl-2的信號傳導(dǎo)能夠加強(qiáng)發(fā)育中的胸腺細(xì)胞和成熟T細(xì)胞的存活[9]。因此，IL-7水平的下降，F(xiàn)as等對胸腺細(xì)胞的致凋亡作用的保護(hù)能力下降是導(dǎo)致在運動性免疫抑制過程中T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化異常的機(jī)制之一。

3.2 運動性免疫抑制發(fā)展中胸腺 TGF-β1應(yīng)答及調(diào)控機(jī)制

TGF‐β在胸腺細(xì)胞本身和胸腺上皮細(xì)胞中都有表達(dá)，主要是作為一個免疫抑制因子，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育。最初觀察TGF-β1影響T細(xì)胞成熟的特異信號的是Plum J等[10]，他報道外源性的TGF-β1劑量依賴性地抑制FTOC胸腺細(xì)胞的生長，胸腺細(xì)胞總數(shù)下降95%以上，DN、DP和CD4+SP胸腺細(xì)胞的分化也受影響，但CD8+SP不受影響。進(jìn)一步對DN細(xì)胞亞群的研究表明，外源性加入 TGF-β1時 DN1亞群為81%，而未經(jīng)處理時為30%，表明TGF-β1抑制DN亞群的增殖主要在DN1階段。Takahama Y等[11]報道，TGF-β1阻止DN細(xì)胞的增殖，控制CD4 CD8low-DP細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，但誘導(dǎo)DN細(xì)胞表達(dá)CD8。Mossalayi MD等[12]研究表明，TGF-β1在 TN細(xì)胞表達(dá)，激活后抑制 TN的增殖，通過自分泌途徑負(fù)性調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞成熟。也有證據(jù)表明 TGF-β影響人類胸腺上皮細(xì)胞(thymic epithelial cells，TECs)：TGF-β1 調(diào)控 TECs細(xì)胞因子表達(dá)影響T細(xì)胞發(fā)育[13]。Christ M等[14]對TGF-β1缺失小鼠的研究中，觀察到胸腺細(xì)胞CD4+SP增加。Boivin GP等[15]的TGF-β1缺失小鼠研究也表明，胸腺細(xì)胞中DP亞群減少，DN和CD4+SP T細(xì)胞增加，提示，TGF-β1可能促進(jìn)DP細(xì)胞向CD8+SP分化，和/或抑制CD4+SP分化。

為了研究 TGF-β1在運動性免疫抑制發(fā)生發(fā)展過程中對胸腺T細(xì)胞發(fā)育的作用，我們分析了TGF-β1在遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練 SD大鼠胸腺中的水平及mRNA表達(dá)的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，TGF-β1在各周運動后明顯升高，恢復(fù)3 h下降，呈現(xiàn)倒∨型變化，TGF-β1 mRNA對負(fù)荷初次應(yīng)答時運動前后沒有明顯變化，其它各周呈倒∨型變化。這表明運動應(yīng)激誘導(dǎo)了TGF-β1在胸腺細(xì)胞中的變化，而且隨著運動負(fù)荷的增加TGF-β1水平逐漸升高，出現(xiàn)上調(diào)趨勢。

TGF-β1水平上升直接可能抑制胸腺細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞發(fā)育分化異常。因此可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，引起運動性免疫抑制。其可能的機(jī)制為：TGF-β1與調(diào)節(jié)DN1到DN2的過渡有關(guān)，促進(jìn)DP細(xì)胞向 CD8+定型，抑制 CD4+分化。因此，TGF-β1的上調(diào)可能直接抑制了DN細(xì)胞的擴(kuò)增，DP細(xì)胞的分化，引起 DN、CD8+細(xì)胞的積聚和(或)CD8+代償性擴(kuò)增，同時CD4+細(xì)胞增殖數(shù)量下降。另外，Suda T等[16]報道，TGF-β1抑制 IL-7依賴的胸腺細(xì)胞的增殖作用。提示本研究中，IL-7下調(diào)以及TGF-β1的上調(diào)可能與胸腺細(xì)胞的分化發(fā)育異常相關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控了免疫抑制的發(fā)生發(fā)展。但它們的信號通路彼此間的相互作用以及在T細(xì)胞發(fā)育中的詳盡歷程等都需要進(jìn)一步研究證實。

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Responsive Characteristics of IL-7 and TGF-β1 in thymus during Exercise-induced Immunosuppression

ZHANG Lin，HAO Xuan-ming
（South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

To investigate the regulatory mechanism of thymocyte development during exercise-induced immunosuppression, IL-7 and TGF-β1 as well as their mRNA of rats in thymus were tested. A total of 128 Sprague–Dawle male rats, aged 8 weeks, were divided into Control Group and Exercise Group. Incremental ergomitry Exercise protocol (10 m·min-1in week1, 20 min week2, 5 m·min-1increased per week, successive 6 weeks, 6 d per week, 30 min per day). Samples were taken in week 0, week 2, week 4 and week 6 before exercise, just after exercise and 3 h after exercise, respectively. IL-7 and TGF-β1 as well as their mRNA of rats in thymus were calculated by ELISA and FQ-RT-PCR. Results:1) During six weeks incremental exercise: The responsive tendency of IL-7 and its mRNA presented the shape of “V” letter during week 0 and week2，while there was no distinguished changes during week4,and last decreased in week6. TGF-β1 and its mRNA presented that of inversed “V” letter during every week, except its mRNA was no prominent change in week0. Conclusion: The decrease of IL-7 and increase of TGF-β1 during Exercise-induced immunosuppression could be resulted the disorder of thymic microenvironment which effected thymocyte development.

exercise biochemistry；exercise-induced immunosuppression；interleukin-7(IL-7)；transforming growth factor beta 1(TGF-β1)；thymus；responsive characteristics

張琳(1971-)，女，在站博士后，研究方向：運動免疫學(xué)。通訊作者：郝選明教授。

G804.7

A

1006-7116(2011)04-0137-04

2010-12-05

廣東省自然科學(xué)基金(9151063101000059)；第49批中國博士后科學(xué)基金面上資助項目(20110490909)。

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