摘要:為了建立快速檢測新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技術(shù)，根據(jù)GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列，設(shè)計(jì)并合成兩套特異性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR試劑盒和自行設(shè)計(jì)合成的引物建立多重RT-PCR反應(yīng)，按照預(yù)期的PCR產(chǎn)物序列合成的DNA作為陽性對照。結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性，可以將甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)與傳統(tǒng)甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亞型流感病毒區(qū)分。該方法同時(shí)具有較高的靈敏度，最低可以檢測到100個(gè)拷貝的陽性克隆質(zhì)粒。在對183份發(fā)熱病人臨床咽拭子樣品檢測中發(fā)現(xiàn)了10份陽性樣品，對350份豬鼻腔拭子樣品檢測全部呈陰性，結(jié)果與中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院試劑盒檢測結(jié)果一致，說明了該多重RT-PCR方法在臨床檢測新型甲型H1N1流感病毒方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:多重RT-PCR;甲型流感病毒;H1N1亞型

中圖分類號:S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1007-273X(2010)10-0008-03

流行性感冒病毒簡稱流感病毒(Influenza virus)，屬正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。按其核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)的不同，可將流感病毒分成甲(A)、乙(B)、丙(C)3型。甲型和乙型流感病毒可以引起大的暴發(fā)流行和嚴(yán)重疾病;丙型流感病毒與普通感冒有關(guān)，主要在兒童中流行[1]。其中甲型流感病毒根據(jù)其表層血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸苷酶蛋白分類成不同亞型，至今為止發(fā)現(xiàn)16×9種不同組合的甲型流感病毒亞型。其中影響人類最重要的流感病毒是H3N2亞型和H1N1亞型，前者往往會與非常大規(guī)模的高死亡率有關(guān)[2]。

流感病毒普遍被認(rèn)為是有能力重組其抗原基因結(jié)構(gòu)和創(chuàng)造新的病毒株，比如改變其毒力、傳染力或者宿主范圍這些生物學(xué)特性[3]?；蛑亟M在兩個(gè)毒株之間發(fā)生是比較頻繁的，但也有可能摻雜來源于不同物種的RNA片段。新型甲型H1N1即是一株在2009年全世界的人類范圍中傳播而暴發(fā)的變種流感H1N1病毒，7月份美國疾控中心(The U.S. Centers for Disease Control and Prevention，CDC)病毒學(xué)家在一名病患身上分離到一株甲型H1N1病毒，發(fā)現(xiàn)這株病毒由4種不同流感病毒株基因重組而成，包含有人流感病毒片段、來自北美和歐亞大陸的豬流感病毒片段和來自北美的禽流感病毒片段，這類病毒之前未曾報(bào)道有從人類或者豬的身上分離得到[4]。

流感病毒在變異重組過程中不斷突破物種隔離和地理隔離的局限，在全世界范圍內(nèi)傳播肆虐，給人類和家畜帶來嚴(yán)重的威脅。由于病毒發(fā)生了變異，以往的病毒疫苗和診斷檢驗(yàn)檢疫技術(shù)已經(jīng)不可以控制該病毒的傳播，建立快速的檢測方法從而進(jìn)行早期診斷是有效防止疫情快速蔓延的方式之一。本研究根據(jù)GenBank中公布的甲型H1N1流感病毒2009年流行株的基因序列，設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測HA和NA基因的多重RT-PCR檢測方法，期望為疫情的控制提供有力的技術(shù)支持。

1材料

傳統(tǒng)的甲型H1N1和H3N2流感滅活病毒由廣東溫氏集團(tuán)股份有限公司贈送。H5N1、H6N2和H9N2亞型流感滅活病毒購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

新型甲型H1N1流感病毒陽性對照由上海旭冠生物技術(shù)有限公司合成，為甲型H1N1病毒2009年流行株HA和NA基因?qū)?yīng)DNA序列。

2方法

2.1特異性引物的設(shè)計(jì)

在GenBank中搜索并獲取2009年甲型H1N1流感病毒流行株的HA和NA的基因序列，利用分子生物學(xué)軟件Clustal X進(jìn)行多重序列比對，找到理想片段后用Primer Premier 5.0進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用Oligo 6.0對引物評價(jià)分析。

為了滿足檢測新型甲型H1N1病毒的要求，引物的設(shè)計(jì)長度控制在15~30bp，引物擴(kuò)增片段在300~

1 000bp之間，其G+C含量35%~60%，Ta值介于50~60℃。無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體、錯(cuò)誤引發(fā)情況及上下引物之間二聚體形成情況，一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上利用BLAST功能對引物與其他基因進(jìn)行同源序列分析。

2.2病毒核酸的提取

取200μL樣品浸出液或滅活病毒用于病毒RNA提取，操作方法按照Invitrogen公司的TRIzol reagent試劑說明書進(jìn)行。用20μL DEPC H2O溶解提取的RNA，-20℃保存?zhèn)溆?。?μL用于多重RT-PCR反應(yīng)。

2.3多重RT-PCR反應(yīng)的建立

多重RT-PCR反應(yīng)采用TaKaRa RT-PCR一步法試劑盒，反應(yīng)體系根據(jù)其說明書進(jìn)行配制，共25μL，其中2×Buffer 12.5μL，引物H1F和H1R各1μL，引物N1F和N1R各1μL，終濃度都為根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定，混合酶1μL，RNA 2μL，DEPC H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2min;然后94℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2.4多重RT-PCR產(chǎn)物測序鑒定

PCR產(chǎn)物送往寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行基因測序，將測序結(jié)果與在GenBank網(wǎng)站公布的新型甲型H1N1基因序列進(jìn)行比對。

2.5多重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5.1最佳多重RT-PCR上下游引物反應(yīng)濃度的確定反應(yīng)條件如2.3中進(jìn)行，分別采用體系中上下游引物濃度均為0.2pmol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/μL、0.8pmol/μL、1.0pmol/μL，25μL體系中其他因素不變進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以確定最佳RT-PCR反應(yīng)的上下游引物濃度。

2.5.2最佳多重RT-PCR反應(yīng)退火溫度的確定利用2.5.1中得出最佳RT-PCR反應(yīng)的上下游引物濃度，在其他條件相同的情況下采取不同的退火溫度進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，分別為53℃、54℃、55℃、56℃、57℃，檢測出最優(yōu)的RT-PCR反應(yīng)退火溫度以保證RT-PCR反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量。

2.6多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)

使用傳統(tǒng)的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒RNA作為陰性對照，在相同的上述優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)，用來評價(jià)該方法的特異性。

2.7多重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)

將H1和N1陽性對照質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)上測定OD260數(shù)值，換算成質(zhì)量濃度，再根據(jù)分子量大小和阿佛加德羅常數(shù)換算成摩爾濃度，即拷貝數(shù)。然后將質(zhì)粒原液10倍梯度稀釋成以下6個(gè)梯度濃度:106、105、104、103、102和10拷貝/μL。用建立的多重RT-PCR體系檢測，檢測到的重組載體的最少拷貝數(shù)即是該多重RT-PCR的靈敏度。

2.8臨床樣品檢測

對珠海各個(gè)口岸采集的183份發(fā)熱病人臨床咽拭子樣品和350份豬鼻腔拭子樣品采用本研究建立的多重RT-PCR進(jìn)行檢測。同時(shí)，平行使用中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院研制的甲型H1N1流感病毒檢測試劑盒對以上陽性樣品進(jìn)行檢測，檢測方法按照其試劑盒說明書進(jìn)行。

3結(jié)果

3.1多重RT-PCR反應(yīng)結(jié)果

分別以引物H1F、H1R和N1F、N1R建立單重RT-PCR反應(yīng)，最后將引物合并于一管中建立多重RT-PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后所得的特異性片段與預(yù)期的片段大小達(dá)成一致，分別為395bp和732bp(圖1)。

3.2多重RT-PCR條件的優(yōu)化

3.2.1上下游引物濃度確定通過2.5.1中得出的瓊脂糖電泳結(jié)果(圖2)可以得知，最佳多重RT-PCR反應(yīng)的上下游引物濃度是0.4pmol/μL。

3.2.2多重RT-PCR反應(yīng)退火溫度的確定用不同的退火溫度進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明55℃為多重RT-PCR反應(yīng)最佳退火溫度(圖3)。

3.3多重RT-PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn)

采取本實(shí)驗(yàn)建立起的多重RT-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，只有陽性對照出現(xiàn)明顯的電泳帶，傳統(tǒng)的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒的檢測結(jié)果均為陰性(圖4)。

3.4多重RT-PCR反應(yīng)的敏感性試驗(yàn)

通過進(jìn)行對上述10個(gè)倍比梯度稀釋濃度的質(zhì)粒模板檢測，從多重RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖可以看出，該方法最低可以檢測到102拷貝/μL的模板(圖5)。

3.5臨床樣品檢測情況

實(shí)驗(yàn)室一直承擔(dān)著檢測新型甲型H1N1流感病毒項(xiàng)目業(yè)務(wù)，先后對183份發(fā)熱病人臨床咽拭子樣品和350份豬鼻腔拭子樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)呈陽性的人咽拭子臨床樣品10份，豬鼻腔拭子樣品中沒有發(fā)現(xiàn)有陽性。陽性樣品結(jié)果與中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院試劑盒檢測結(jié)果一致。

4討論

2009年4月墨西哥暴發(fā)的流感疫情被確認(rèn)為新型甲型H1N1流感之后，世界各地紛紛投入大量的人力物力資源進(jìn)行新型甲型H1N1流感診斷檢測技術(shù)的研究，試圖進(jìn)一步遏制住疫情的蔓延傳播，接著各種關(guān)于新型甲型H1N1流感病毒的檢測技術(shù)相繼出現(xiàn)。相對于傳統(tǒng)的病毒診斷檢測方法，一般是采用病毒分離法，該方法利用收集的動(dòng)物咽肛拭子和疑似病料接種SPF雞胚或MDCK細(xì)胞，然后對培養(yǎng)物進(jìn)行血凝反應(yīng)等的血清學(xué)診斷，此診斷方法操作繁雜、實(shí)驗(yàn)周期長、在采集樣品和培養(yǎng)病毒的過程中造成環(huán)境的污染，而且隨著病毒新的血清亞型、新的變異株不斷地出現(xiàn)，傳統(tǒng)的病毒分離法在實(shí)際應(yīng)用中的局限性越來越明顯。

本實(shí)驗(yàn)突破傳統(tǒng)病毒診斷檢測方法的局限性，表現(xiàn)快速、方便、流通量大等優(yōu)點(diǎn)，從特異性實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)驗(yàn)建立起的多重RT-PCR體系只針對2009年出現(xiàn)流行的甲型H1N1流感毒株，并不能擴(kuò)增之前公布的甲型H1N1流感病毒和其他流感病毒，具有高度的特異性。在敏感性檢查中，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測到低至核酸濃度達(dá)到102拷貝/μL的水平，檢測靈敏度高。所以本實(shí)驗(yàn)非常適合新型甲型H1N1流感病毒的快速檢測工作。

參考文獻(xiàn):

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