【摘要】目的:比較冰凍血小板和新鮮血小板輸注后血液的促凝功能。方法:該課題以100名志愿患者為研究對(duì)象，抽取其新鮮血液2ml后，隨機(jī)輸注50份冰凍血小板和50份新鮮血小板懸液，24小時(shí)后重新采血。分別經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)冰凍血小板和新鮮血小板輸注前后的β-血小板球蛋白(β thromboglobulin，β-TG)、血小板α-顆粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140，GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)。采用Born氏比濁法檢測(cè)冰凍血小板和新鮮血小板輸注前后的聚集率，所用誘導(dǎo)劑的終濃度為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)782.0 micro;mol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)47.6micro;mol/L和膠原(collagen)4.8mg/L。結(jié)果:冰凍血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4分別為(51.5±4.4)ng/ml、(32.1±6.8)ng/ml和(25.5±4.9)ng/ml，新鮮血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4分別為(40.3±4.0)ng/ml、(24.3±4.8)ng/ml和(18.8±3.6)ng/ml，冰凍血小板釋放的β-TG、GMP-140和PF4均高于新鮮血小板(P<0.05)。在AA、ADP和膠原的誘導(dǎo)下，冰凍血小板的聚集率分別為(81.15±6.39)%、(83.04±6.09)%和(81.25±8.28)%，新鮮血小板的聚集率分別為(76.11±5.77)%、(76.59±5.30)%和(72.40±6.94)%，冰凍血小板對(duì)AA、ADP和膠原的聚集率均高于新鮮血小板(P<0.05～0.01)。結(jié)論:冰凍血小板的促凝血功能強(qiáng)于新鮮血小板，在血源日趨緊張的今天，可以大量長(zhǎng)期儲(chǔ)備冰凍血小板，以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用血小板的需求。

【關(guān)鍵詞】冰凍血小板;新鮮血小板;促凝功能

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-028-2

機(jī)采新鮮濃縮血小板，簡(jiǎn)稱(chēng)新鮮血小板。目前臨床上廣泛應(yīng)用機(jī)采新鮮血小板輸注治療血小板減少性疾病，但由于機(jī)采新鮮濃縮血小板的來(lái)源有限，滿(mǎn)足不了臨床的需求，便應(yīng)用冰凍新鮮血小板的臨床輸注[1]。冰凍血小板雖然具有保存期長(zhǎng)、無(wú)污染危險(xiǎn)、使用方便、隨用隨取以及有利于出血性危重患者的及時(shí)搶救治療等優(yōu)點(diǎn)[2]，但其促凝功能與新鮮血小板不同。β-血小板球蛋白(β thromboglobulin，β-TG)、血小板α-顆粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140，GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)是血小板特異性球蛋白，在血小板活化時(shí)由血小板內(nèi)的α顆粒釋放[3，4]，測(cè)定β-TG、GMP-140和PF4的含量可反映血小板的促凝功能。本文比較了冰凍血小板和新鮮血小板的輸注后機(jī)體促凝功能變化。

1材料與方法

1.1血小板制品

冰凍血小板和機(jī)采新鮮血小板均來(lái)自汕頭市中心血站。新鮮血小板使用MCS+血細(xì)胞分離機(jī)(美國(guó)血液技術(shù)公司)采集，供者均符合《衛(wèi)生部獻(xiàn)血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)》，機(jī)器連續(xù)采集獻(xiàn)血者全血3000～4000ml，獲得濃縮血小板懸液終體積220～250ml為1個(gè)治療量，其血小板數(shù)值>215×1011，于當(dāng)日采集后3h內(nèi)輸注，輸注量為1個(gè)治療量。采集出的新鮮血小板在無(wú)菌條件下注入濃度為4%～6%的二甲基亞砜，置于-8°C以下冰箱內(nèi)保存即為冰凍血小板，保存期為半年。

1.2血小板輸注

隨機(jī)選擇100名志愿輸注新鮮血小板或冰凍血小板患者，輸注前分別先抽取新鮮血液2ml。分別取50份冰凍血小板和50份新鮮血小板懸液，每份20單位。冰凍血小板輸注前置42°C恒溫箱解凍，經(jīng)生理鹽水洗滌。采用隨機(jī)輸注方法，輸注24小時(shí)后再分別抽取新鮮血液2ml。

1.3β-TG、GMP-140和PF4檢測(cè)

將輸注前后分別抽取的新鮮血液，3000×g離心20min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosor

-bent assay，ELISA)檢測(cè)β-TG、GMP-140和PF4。試劑采用羅氏公司(Roche Diagnostics)的ELISA試劑盒，變異度分析控制在15%以?xún)?nèi)。

1.4血小板聚集功能

采用Born氏比濁法[5]檢測(cè)輸注前后血小板的聚集率，所用誘導(dǎo)劑的終濃度為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)782.0micro;mol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)47.6micro;mol/L和膠原(collagen)4.8mg/L。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)按公式“促凝功能變化=輸注后促凝功能-輸注前促凝功能”，以x±s表示，采用SPSS軟件包進(jìn)行完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)資料的方差分析。

2結(jié)果

2.1輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板β-TG的表達(dá)情況

圖1 冰凍血小板和新鮮血小板β-TG的表達(dá)情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

ELISA檢測(cè)顯示，輸注冰凍血小板后β-TG為51.5±4.4ng/ml，輸注新鮮血小板β-TG為40.3±4.0ng/ml，輸注冰凍血小板后釋放的β-TG高于新鮮血小板(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.2輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板GMP-140的表達(dá)情況

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，輸注冰凍血小板后GMP-140為32.1±6.8ng/ml，輸注新鮮血小板后機(jī)體GMP-140為24.3±4.8ng/ml，輸注冰凍血小板后GMP-140高于新鮮血小板(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 冰凍血小板和新鮮血小板GMP-140的表達(dá)情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

2.3輸注前后冰凍血小板和新鮮血小板PF4的表達(dá)情況

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，輸注冰凍血小板后PF4為25.5±4.9ng/ml，輸注新鮮血小板后PF4為18.8±3.6ng/ml，輸注冰凍血小板后PF4高于新鮮血小板(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 冰凍血小板和新鮮血小板PF4的表達(dá)情況

*:與冰凍血小板相比，P<0.05

2.4輸注冰凍血小板和新鮮血小板后機(jī)體的聚集功能

在AA、ADP和膠原的誘導(dǎo)下，冰凍血小板的聚集率均高于新鮮血小板(P<0.05～0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 冰凍血小板和新鮮血小板的聚集率(%)

組別誘聚劑

AAADP膠原

冰凍血小板

新鮮血小板81.15±6.39

76.11±5.77*83.04±6.09

76.59±5.30*81.25±8.28

72.40±6.94**

注:*:與冰凍血小板相比，與P<0.05;**:與冰凍血小板相比，與P<0.01。

3討論

血小板的功能包括粘附、聚集和促凝等方面，從廣義上講，血小板的粘附和聚集也屬于促凝功能[6]。臨床上，無(wú)論是靜脈出血還是動(dòng)脈出血，輸注血小板的目的都是為了盡快止血，因而血小板的促凝功能是最關(guān)鍵的。

β-TG是血小板α顆粒合成的特異性蛋白，由四條肽鏈組成，通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生成前列環(huán)素(prostacyclin，

PGI2)而發(fā)揮促凝作用[7]。由于β-TG主要存在于血小板中，因此測(cè)定血小板釋放的β-TG已成為反映血小板促凝功能的一項(xiàng)指標(biāo)。GMP-140是血小板激活脫顆粒反應(yīng)中α顆粒釋放的遺留產(chǎn)物，在血小板被激活時(shí)被釋放出來(lái)，可促進(jìn)細(xì)胞之間的連接，具有介導(dǎo)活性血小板與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的功能，在凝血過(guò)程中起重要作用。因而GMP-140也是反映血小板促凝活性的分子標(biāo)志物之一[8]。PF4是血小板α顆粒中的另外一種活性因子，為四聚體糖蛋白，由相同的70個(gè)氨基酸單體以共價(jià)鍵結(jié)合，單體的相對(duì)分子質(zhì)量為7800。每個(gè)單體的N末端具有可變區(qū)，單體通過(guò)此區(qū)以?xún)蓚€(gè)二硫鍵錨定在PF4蛋白質(zhì)核心上，此區(qū)由3個(gè)非平行β折疊和一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)組成[9]。PF4在血小板粘附、聚集、活化時(shí)以蛋白多糖復(fù)合物的形式從血小板中釋放，能降低內(nèi)皮細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素的抗凝作用，并使血小板聚集，促進(jìn)血液在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面凝固，因此PF4也是反映血小板促凝反應(yīng)的標(biāo)記物[10]。我們的研究結(jié)果表明，機(jī)體輸注冰凍血小板后釋放β-TG、GMP-140和PF4多于輸注新鮮血小板，說(shuō)明輸注冰凍血小板后機(jī)體的促凝功能強(qiáng)于輸注新鮮血小板。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在AA、ADP和膠原分別作為誘聚劑的情況下，輸注冰凍血小板后的血液聚集率均高于輸注新鮮血小板后。血小板聚集是血小板的主要功能之一，在止、凝血過(guò)程中，血小板聚集起著關(guān)鍵的作用[11]。因此，血小板聚集功能在一定程度上反映了血小板的促凝活性。此外，Owens[12]等報(bào)道患者輸注新鮮血小板后，血小板的粘附能力只有輸注冰凍血小板的53%，提示冰凍血小板的粘附功能也強(qiáng)于新鮮血小板。冰凍血小板的粘附能力和促凝活性增強(qiáng)可能與冰凍后血小板對(duì)于凝血因子V的結(jié)合能力增強(qiáng)有關(guān)。劉景漢[13]等通過(guò)觀察大量血小板輸注的臨床病例，發(fā)現(xiàn)冰凍機(jī)采血小板的止血效果優(yōu)于常規(guī)保存液體血小板，尤其是冰凍血小板輸注取得了滿(mǎn)意療效。在該試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)輸注冰凍血小板后機(jī)體的促凝功能明顯優(yōu)于輸注新鮮血小板后。我們?cè)谂R床工作中也發(fā)現(xiàn)，冰凍血小板輸血反應(yīng)的發(fā)生率低于新鮮血小板，而且取得了較為滿(mǎn)意的效果。滕本秀等[14]則通過(guò)臨床實(shí)踐，證實(shí)了冰凍新鮮血小板除了具有新鮮血小板的優(yōu)點(diǎn)外，還具有保存期長(zhǎng)，無(wú)污染危險(xiǎn)，使用方便，隨用隨取等優(yōu)點(diǎn)，因而更有利于危重出血患者的搶救治療。但輸注冰凍血小板之后，血小板計(jì)數(shù)的增加不及輸注新鮮血小板后明顯[15]。

綜上所述，冰凍血小板的促凝血功能強(qiáng)于新鮮血小板，并且有充足的時(shí)間進(jìn)行病毒檢測(cè)，減少了傳染性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。雖然冰凍血小板在提升血小板計(jì)數(shù)方面不及新鮮血小板，但是在血源日趨緊張的今天，經(jīng)深低溫保存的冰凍血小板在安全性和止血效果方面均尤于新鮮血小板，可以大量長(zhǎng)期儲(chǔ)備，以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用血小板的需求。

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