【摘要】目的:研究結(jié)腸癌患者外周血血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因多態(tài)性分布規(guī)律。方法:30例患者為研究組，30例正常人為對(duì)照組，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，對(duì)入組的結(jié)腸癌患者外周血中ACE基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以了解ACE基因插入型(ID型)、缺失型(DD型)和Ⅱ型3種基因型及I/D等位基因在結(jié)腸癌患者外周血中的分布規(guī)律，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果:結(jié)腸癌患者外周血ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性分布:ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型的占比分別為36.67%、6.67%、56.66%，I/D等位基因分布頻率分別為53.30%和46.70%，對(duì)照組ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型的占比分別為53.33%、16.67%、30.00%，I/D等位基因分布頻率分別為43.33%和56.67%，兩組間基因型分布頻率和I/D等位基因分布頻率均有顯著差異(p<0.05)。結(jié)論:結(jié)腸癌患者外周血ACE基因多態(tài)性中，Ⅱ型基因分布升高和D等位基因分布頻率降低可能與結(jié)腸癌發(fā)病相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶;基因多態(tài)性;頻率

【中圖分類號(hào)】R735.3+5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)16-099-2

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)是高血壓病和腎病等研究的熱點(diǎn)基因。近年來(lái)，結(jié)腸癌與ACE基因的關(guān)系受到重視，歐洲一項(xiàng)臨床研究顯示，ACE抑制劑(ACEI)能明顯降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)，提示ACE與結(jié)腸癌發(fā)病可能存在一定關(guān)系[1]。有鑒于此，我們開展了本研究，觀察結(jié)腸癌患者ACE基因多態(tài)性，試圖了解示ACE基因與結(jié)腸癌發(fā)病之間的關(guān)系。

ACE基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂q23位點(diǎn)，長(zhǎng)度為21kb，其第16內(nèi)含子存在一段287bp的DNA序列的插入(insertion，I)或缺失(deletion，D)，構(gòu)成ACE基因I/D多態(tài)性，ACE基因可分出I等位基因和D等位基因，并可劃分出三種基因型:缺失純合子型(DD型)、缺失與插入純合子型(ID型)、插入純合子型(Ⅱ型)[2-3]。對(duì)ACE等位基因及基因型的多態(tài)性研究有可能揭示兩者之間的關(guān)系，從而對(duì)ACEI用于結(jié)腸癌的治療提供理論依據(jù)。迄今，有關(guān)ACE基因與結(jié)腸癌關(guān)系的論著甚少，且結(jié)論有相互矛盾的地方，因此，本研究的開展，對(duì)于揭示ACE基因多態(tài)性與結(jié)腸癌發(fā)病之間的關(guān)系，具有一定的理論意義。

本文檢測(cè)30例結(jié)腸癌患者外周血中ACE基因DD型、ID型和Ⅱ型3種基因型和I、D等位基因的分布頻率，并與30例正常人外周血ACE基因分布進(jìn)行比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1病例入選標(biāo)準(zhǔn)共30例，符合下列納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn):①臨床確診結(jié)腸癌患者;②所有病例須有病理報(bào)告證實(shí);③年齡40-70周歲;排除標(biāo)準(zhǔn):①不符合結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)者;②未取得病理報(bào)告證實(shí)者;③年齡<40歲或>70歲者;④原發(fā)性高血壓病患者;⑤合并嚴(yán)重心、腦、腎、血液系統(tǒng)疾病患者;⑥精神病患者;⑦不愿意接受本研究措施者。

1.2患者情況年齡40-70周歲，其中男性18例，女性12例，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期者17例，Ⅲ-Ⅳ期者13例，結(jié)腸腺癌1例，結(jié)腸中分化腺癌10例，結(jié)腸中低分化腺癌3例，結(jié)腸乳頭狀腺癌2例，結(jié)腸潰瘍性中分化腺癌2例，結(jié)腸粘膜浸潤(rùn)性腺癌1例，結(jié)腸中分化粘液腺癌1例，結(jié)腸低分化腺癌2例，結(jié)腸管狀腺癌2例，結(jié)腸中分化管狀腺癌6例。研究組與對(duì)照組除結(jié)腸癌外，在一般情況方面比較均無(wú)顯著差異(p>0.05)。

1.3DNA提取采用蛋白酶K消化酚-氯仿抽提法。

1.4引物合成和PCR擴(kuò)增引物由上海生工合成，序列如下:

ACE-Ⅰ-upper:5'-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3'

ACE-Ⅰ-down:5'-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3'

擴(kuò)增片段大小，插入型為597bp，缺失型為319bp。PCR擴(kuò)增體系體積為25micro;l，反應(yīng)體系含Taq酶1.0micro;l，10×buffer2.5micro;l，10mMdNTP0.5micro;l，引物(10pmol/micro;l)各0.5micro;l，模板gDNA約100ng。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃30”，56℃45”，72℃1分鐘，共35個(gè)循環(huán);最后72℃5分鐘。試劑均購(gòu)自Takara公司。對(duì)于基因型為缺失型純合子(DD)型的個(gè)體再用特異性擴(kuò)增插入片段的ACE-Ⅱ進(jìn)行驗(yàn)證，如擴(kuò)增出目的片段則為ID型。ACE-Ⅱ引物序列如下:

ACE-Ⅱ-upper:5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3'

ACE-Ⅱ-down:5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3'

擴(kuò)增片段大小為335bp，退火溫度為65℃，反應(yīng)條件同ACE-Ⅰ。

1.5PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳約30分鐘，電壓100v，在紫外燈下觀察條帶。Marker為DL2000。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間頻率比較采用X2檢驗(yàn)，以p<0.05有顯著差異。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

各標(biāo)本取10micro;l產(chǎn)物加樣，電泳，按常規(guī)攝片，因:ACEI/D多態(tài)性PCR檢測(cè)結(jié)果。319bp片段(D等位基因)的表達(dá)及319bp和579bp片段(I等位基因)的同時(shí)表達(dá)表示ACE基因的DD，ID和Ⅱ幾種基因型。M:標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照;4，7，22，25和29:DD純合子;1，3，8，10，11，13，14和17:ID雜合子;2，5，6，9，12和15:Ⅱ純合子。

2.2基因型分析

ACE基因型的分布結(jié)果，研究組11例標(biāo)本為缺失雜合子(ID型)，占比36.67%(11/30);2例標(biāo)本為缺失純合子(DD型)，占比6.67%(2/30);17例標(biāo)本為插入純合子(II型)，占比56.66%(17/30);對(duì)照組:ID型、D型、II型的占比分別為53.33%、16.67%、30.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組患者在ID型、DD型、II型基因的分布頻率上有顯著差異(X2=4.410，p<0.05)。

結(jié)腸癌患者ACE等位基因檢測(cè)結(jié)果，結(jié)腸癌患者組D和I等位基因的分布頻率分別為43.33%和56.67%，正常對(duì)照組分別為70.00%和30.00%，結(jié)腸癌患者和正常人外周血ACED和I等位基因存在顯著差異(X2=4.344，p=0.037)。我們還對(duì)ACE基因多態(tài)性和I/D等位基因進(jìn)行了亞組分析，由于樣本數(shù)量的原因，在性別、病理類型、臨床分期、吸煙史及家族史等因素均未表現(xiàn)出對(duì)ACE基因表達(dá)的影響。

3討論

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-Ⅰ(ACE-Ⅰ)在生理情況下通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)導(dǎo)致血管收縮和血壓升高，并具有影響腫瘤細(xì)胞增殖、游走、新生血管生成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[4]。此外，還可能通過(guò)在細(xì)胞周期中誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)基因表達(dá)而發(fā)揮致癌因素作用，在體實(shí)驗(yàn)表明AngⅡ受體拮抗劑能有效抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)依賴性腫瘤的生長(zhǎng)。

Eleftherios氏于2007年報(bào)道，ACE基因I/D多態(tài)性通過(guò)影響ACE基因表達(dá)而與口腔癌的發(fā)病相關(guān)[5]。但ACE基因與結(jié)腸癌關(guān)系的研究尚無(wú)定論，因此本研究具有一定的新意。結(jié)果表明結(jié)腸癌患者外周血與正常人ID、DD及Ⅱ型基因頻率的分布有顯著性差異，Ⅱ型基因頻率顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，DD型和ID型顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，初步證明ACE基因的插入多態(tài)性可能為結(jié)腸癌發(fā)病的重要遺傳因素之一，但與正常人比較，結(jié)腸癌患者I/D等位基因分布無(wú)顯著性差異，我們的結(jié)果初步表明ACE基因多態(tài)性可能與結(jié)腸癌發(fā)病相關(guān)。但本研究尚存在一定的不足之處，尚需進(jìn)行更加深入的基礎(chǔ)與臨床研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Christian JB，Lapane KL，Hume AL，et al. Association of ACE inhibitors and angiotensin receptor blockers with keratinocyte cancer prevention in the randomized VATTC trial[J].J Natl Cancer Inst，2008.