【摘要】目的:探討CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的晝夜節(jié)律性變化情況。方法:10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲。預(yù)先在晝夜節(jié)律模式條件(16h-light:8h-dark cycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時間:7:00，睡眠時間(無光照期):23:00～7:00，早餐時間:7:30～8:00，午餐時間:11:30～12:00，晚餐時間:5:00～6:00;睡眠時光照強度<0.1 Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動和飲食成分基本一致。隨后在一晝夜內(nèi)每隔4h抽取各受試者外周血3ml，用流式細胞儀測定CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞占CD4+T細胞的百分比，通過余弦法和Clock Lab軟件獲取節(jié)律參數(shù)，并經(jīng)振幅檢驗分析是否存在晝夜節(jié)律。結(jié)果:在自然光制下，CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的相對數(shù)量均呈現(xiàn)晝高夜低的節(jié)律性振蕩(P<0.05)，但各細胞相對數(shù)量變化的峰谷時點略有不同。結(jié)論:人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞的變化均存在著晝夜節(jié)律性特征。

【關(guān)鍵詞】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;晝夜節(jié)律;T細胞

【中圖分類號】R331.1+44【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)16-074-2

晝夜節(jié)律生物鐘是一種普遍的生物活動現(xiàn)象。哺乳類動物的生物鐘已被定位于下丘腦前部的視交叉上核(suprachias

-matic nucleus，SCN)和松果體[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)的組成和功能，如免疫細胞數(shù)量、免疫球蛋白的濃度、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等都存在晝夜節(jié)律性變化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞是一類已活化的免疫細胞，在免疫應(yīng)答中起著重要的作用[3]。對于這些活化的T淋巴細胞的晝夜節(jié)律性的表達，到目前為止，研究報道并不多。本實驗在模擬自然光制條件下，測定不同晝夜時點外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞表達的變化，以確定其是否存在晝夜節(jié)律特征。

1材料和方法

1.1研究對象與造模

10名健康男性志愿者，年齡24～30歲，平均25歲;既往身體健康，無感染性和自身免疫性疾病，在過去6個月內(nèi)未做過跨時區(qū)旅行和未接受過藥物治療。預(yù)先在實驗室晝夜節(jié)律模式條件(自然光制，16h-light:8h-darkcycle，LD)下生活1周:室溫25±1ordm;C，起床時間:7:00，睡眠時間(無光照期):23:00～7:00，早餐時間:7:30～8:00，午餐時間:11:30～12:00，晚餐時間:5:00～6:00;睡眠時光照強度<0.1Lux;受試者自由飲水，無煙酒嗜好，日常活動和飲食成分基本一致。

1.2樣品采樣

將外界自然光照起點時間設(shè)定為晝夜0時點(自然時間凌晨5時)，把24h自然時點轉(zhuǎn)換成晝夜時點(zeitgeber time，ZT)。受試者在實驗室生活1周后，在一晝夜內(nèi)每隔4h按不同晝夜時點(ZT02、06、10、14、18、22，n=6)分別采集其外周靜脈血，每份取樣3ml，每組(每個時點)n=10，肝素抗凝后立即于流式細胞儀檢測三種細胞的百分比。

1.3儀器與試劑

Epics XL#8226;MCL流式細胞分析儀，美國Beckman Coulter公司;CD4單克隆抗體(FITC標記)，CD25單克隆抗體(PE標記)，CD69單克隆抗體(PC5標記)，HLA-DR單克隆抗體(PE標記)，美國Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde)，美國Beckman Coulter公司;PBS緩沖液，自制。

1.4流式細胞分析

取兩根試管，一管加CD4單克隆抗體10μl、CD69單克隆抗體4μl和CD25單克隆抗體10μl到小試管底部，第二管加CD4、HLA-DR單克隆抗體各10μl到小試管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小試管中，避免懸液沾到試管壁。充分混勻，室溫下避光放置15min。加入2501μl溶血素，振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS緩沖液振蕩混勻后置37℃水浴15min。加入1mlPBS緩沖液振蕩混勻后1800r/min離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁，加入250μlPBS緩沖液，振蕩混勻備用。流式細胞儀進行光路質(zhì)量調(diào)控和雙色熒光補償，以前向角FSLIN與側(cè)向角SSLIN取淋巴細胞設(shè)門，用流式細胞儀分析50000個細胞應(yīng)用配套分析軟件獲取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR雙陽性細胞占淋巴細胞的百分比。每批測定時，以空白管調(diào)整零點。

1.5數(shù)據(jù)處理

用余弦分析軟件和Clock Lab軟件獲取晝夜節(jié)律性參數(shù)，并經(jīng)振幅F檢驗確定靶細胞晝夜節(jié)律性表達的變化。用于擬合的余弦函數(shù)方程為:F(t)=M+Acos(ωt+Φ)，其中M(mesor)為中值，即漲落變化的中線;A(amplitude)為節(jié)律振蕩的振幅，表示向上或向下波動的幅度;Φ(peak phase or acrophase)為峰值相位，是振蕩達到峰值的時刻，可根據(jù)ω角速度(360°/24h)將其換算成各ZT時點。數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，組內(nèi)差異用SPSS17.0 for Windows統(tǒng)計軟件包進行t檢驗;組間差異用相同軟件包進行方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異具有顯著性。

2結(jié)果

在LD(16:8)光制下的不同晝夜時點，以CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞百分比作為相對數(shù)量變化水平，各細胞的晝夜節(jié)律性變化反映于表1;對各晝夜時點變化的數(shù)據(jù)進行余弦函數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這三種細胞均具有明顯的晝夜節(jié)律性變化(振幅F檢驗，P<0.05)。

表1 在 LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞各晝夜時點表達的變化

LD(16:8)光制下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞變化的晝夜節(jié)律性參數(shù)反映于表2，CD4+CD25+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT19和ZT7，CD4+CD69+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT13和ZT1，CD4+HLA-DR+T細胞百分比的峰值和谷值時間分別位于ZT13和ZT1。

表2 在LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞表達的晝夜節(jié)律參數(shù)

LD(16:8)光制下，人外周血CD4+CD25+T淋巴細胞晝夜節(jié)律性變化的時間外觀趨勢和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖1。CD4+CD69+T淋巴細胞晝夜節(jié)律性變化的時間外觀趨勢和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖2。CD4+HLA-DR+T淋巴細胞晝夜節(jié)律性變化的時間外觀趨勢和經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線呈現(xiàn)于圖3。

圖1CD4+CD25+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖2CD4+CD69+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

圖3CD4+HLA-DR+ T細胞變化的時間外觀趨勢圖(左)，經(jīng)余弦函數(shù)分析擬合后的余弦曲線(右)。

3討論

人們很早以來就知道生物體的活動具有節(jié)律性，這是生物體為了更好適應(yīng)環(huán)境要求而發(fā)生的反應(yīng)。其中晝夜節(jié)律是最為重要的一種生物節(jié)律。近年來時間免疫學[4]的研究表明，動物和人的免疫系統(tǒng)也具有多種顯性節(jié)律。目前，研究人員對免疫系統(tǒng)的節(jié)律性研究較多的是針對免疫器官、免疫細胞和免疫分子的數(shù)量和功能。CD25、CD69和HLA-DR是免疫細胞活化時特有的表達分子?；罨牧馨图毎攀橇馨拖到y(tǒng)的功能細胞，因此，本研究著重從活化的T細胞的節(jié)律性變化著手研究，以探討這些活化的T細胞是否同樣具有晝夜節(jié)律性的變化。

本實驗中對LD(16:8)光制(即自然光制)條件下，正常成人6個不同晝夜時點采集的外周血標本進行研究，發(fā)現(xiàn)自然光制條件下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞存在著晝夜節(jié)律性變化，三種細胞變化的節(jié)律振幅、中值和峰值相的水平并不相同，而其節(jié)律相位也略有不同。CD4+CD25+T淋巴細胞峰值時間點位于晝夜時點的ZT19，谷值時間點位于ZT7。CD4+CD69+T淋巴細胞和CD4+HLA-DR+T淋巴細胞峰值時間點均位于晝夜時點的ZT13，谷值時間點均位于ZT1。三種細胞中后兩者峰值時間點均早于前者，這可能是由于三種活化分子(CD25，CD69，HLA-DR)在T淋巴細胞活化時表達的早晚差異造成。

由于外周血淋巴細胞的數(shù)量本身存在著節(jié)律性的變化[5]，因此本實驗對三種細胞的相對數(shù)量進行了研究，避免了因淋巴細胞數(shù)量的變化而引起三種細胞絕對數(shù)量的改變。雖然研究人員很早就知道中樞核心晝夜節(jié)律調(diào)控組織主要定位于下丘腦前部的視交叉上核、松果體和視網(wǎng)膜。它通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著人體的晝夜節(jié)律變化，但隨著對免疫系統(tǒng)晝夜節(jié)律研究的深入，我們已經(jīng)知道，免疫細胞中也存在著一些晝夜節(jié)律相關(guān)的基因，而且這些基因本身存在著節(jié)律性的變化，那么本實驗研究的結(jié)果到底是中樞核心晝夜節(jié)律調(diào)控組織發(fā)揮作用還是免疫系統(tǒng)中這些節(jié)律性基因在發(fā)揮調(diào)控作用卻有待于進一步的探討。

參考文獻

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