[摘要]目的:研究黃褐斑皮膚的組織學(xué)改變及角蛋白10(CK10) 的表達(dá)情況。方法:取黃褐斑患者瞼袋術(shù)后外眥多余皮膚，行石蠟切片的HE染色、Fontana-Masson染色和CK10的免疫組化染色，觀察此處皮膚的病理學(xué)改變和CK10的分布情況。結(jié)果:黃褐斑皮損處表皮變薄，基底層細(xì)胞周圍可見明顯色素顆粒，基底上層、毛囊上段、真皮層也有色素顆粒分布，真皮膠原紊亂、斷裂，皮膚附屬器數(shù)量較少。CK10主要分布在表皮的基底上層和皮脂腺細(xì)胞的胞漿和腺泡的外層。結(jié)論:黃褐斑病損皮膚各層黑色素含量增多，皮膚組織結(jié)構(gòu)多有老化表現(xiàn)。CK10在基底上層表達(dá)增強(qiáng)，其表達(dá)增強(qiáng)可能與表皮細(xì)胞過度分化、皮膚老化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]黃褐斑;色素性疾病;組織結(jié)構(gòu);角蛋白10;皮膚老化

[中圖分類號(hào)]R758.4+2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)09-1340-03

Histological features of melasma lesions and the expression of keratin 10

TANG Jian-bing1，CHENG Biao1，Zhang Wei2， LI Qin1，LIU Da-Lie1， YU Wen-Lin1，ZENG Dong1，LIAO Yuan-xing1

(1.Plastic and Aesthetic Center;2.Department of Pathology， Guang zhou Military Command General Hospital， Guangzhou 510010 Guang dong，China)

Abstract: Objective To investigate the histological changes of the skin with melasma and keratin 10 (CK10) expression. Methods The excess skin in the lateral canthus was acquired after eyelid plasty operation for melasma patients，the paraffin sections was stained with HE，F(xiàn)ontana-Masson and CK10 immunohistochemical staining to observe the pathological changes of the melasma skin and the distribution of CK10.ResultsThe epidermis was thin in the melasma skin. And the melanin can be seen clearly around the basal layer cells.It could be seen in the upper basal layer， the upper hair follicle and dermis. Dermal collagen was disorder， fracture， the number of skin appendages was less than the normal skin. CK10 mainly distributed in the upper stratum of basal epidermis and the most outer layer of sebaceous glands. ConclusionThe content of melanin increases in melasma skin， and skin aging features appear in the histological structure. CK10 expresses strongly in the upper stratum of basal epidermis which maybe relate with the excessive differentiation of epidermal cells and the skin aging.

Key words: melasma; pigment disorders; histological structure; keratin 10; skin aging

黃褐斑是臨床常見的一種獲得性色素增加性皮膚病，亞洲人種以面部的顴頰、下瞼、鼻根等部位好發(fā)，關(guān)于黃褐斑組織病理改變方面的研究還比較少。角蛋白屬于細(xì)胞骨架中中間絲蛋白家族，它是在細(xì)胞的增殖、分化和成熟過程中形成的，細(xì)胞角蛋白的表達(dá)情況也間接反映了細(xì)胞的增殖和分化情況[1]。我們利用常規(guī)HE染色、Fontana-Masson染色和免疫組化染色觀察了黃褐斑皮損的組織結(jié)構(gòu)變化和角蛋白10的分布情況。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本:取16例黃褐斑患者的瞼袋整形術(shù)后外眥處多余皮膚組織做病理檢測，取5例無明顯色斑的瞼袋患者術(shù)后皮膚作對(duì)照檢測。所有黃褐斑患者均符合中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)色素病學(xué)組《關(guān)于黃褐斑的臨床診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》(2003年修訂稿)[2]。

1.2 試劑: 抗體:CK10McAb(克隆號(hào):DE-K10)為福建邁新公司產(chǎn)品，SP試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1 皮膚組織用福爾馬林固定，作石蠟切片，按照常規(guī)方法行HE染色和Fontana-Masson染色(膠原纖維采用Van Gieson氏液作對(duì)比染色)[3]。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色(SP法):①石蠟切片用二甲苯脫蠟水化;②阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、3%H2O2甲醇水溶液室溫下10min;③抗原修復(fù):采用熱修復(fù)法;④正常羊血清封閉，室溫10min;⑤滴加角蛋白10抗體在濕盒中，室溫或37℃，1～2h，PBS洗片;⑥滴加生物素化二抗，室溫10min，PBS洗片;⑦滴加適量鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，室溫10min，PBS洗片;⑧DAB顯色約3～5min，顯微鏡下觀察至特異性染色清晰，終止顯色自來水沖洗;⑨蘇木素復(fù)染;⑩梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片觀察。棕黃色為陽性反應(yīng)。

1.3.3 免疫組化結(jié)果判斷:選取5例黃褐斑患者和5例無色斑皮膚的CK10免疫組化染色切片，每張切片在40×10光鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)表皮層的視野，共觀察30個(gè)視野。表皮層細(xì)胞胞漿上呈現(xiàn)棕色或者棕黃色顆粒為陽性，并對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。半定量判定:①染色強(qiáng)度:無染色為0分，淡染色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分;②陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞陽性數(shù)≤5%為0分(陰性)，5%～25%為1分，25%～50%為2分，細(xì)胞陽性數(shù)≥50%為3分。取兩項(xiàng)總分，0分為陰性-，1～2分為+，3～4分為++，5～6分為+++。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分析病損皮膚和正常皮膚CK10表達(dá)的差異。

2結(jié)果

2.1 組織學(xué)特征:黃褐斑皮損處表皮變薄，角質(zhì)層增厚?；讓雍图瑢蛹?xì)胞周圍可見明顯色素顆粒， HE染色中黑素顆粒呈紅褐色，F(xiàn)ontana-Masson染色中黑素顆粒呈黑色，膠原纖維呈紅色。色素大多數(shù)位于表皮基底層和釘狀突，少數(shù)位于毛囊上段、基底上層及真皮層，并呈傘狀或者帽樣包繞在細(xì)胞核周圍。真皮膠原紊亂、斷裂，皮膚附屬器數(shù)量較少。非病損皮膚真皮層膠原密度高，排列有序，汗腺、毛囊數(shù)量較多，基底上層和真皮層少見色素顆粒(見圖1～4)。

2.2 CK10染色結(jié)果:CK10在正常皮膚和病損皮膚的基底上層、外根鞘內(nèi)層和皮脂腺腺泡的外層均有一定程度表達(dá)，但在黃褐斑病損基底上層中表達(dá)更為明顯(見圖5～6)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:病損皮膚和正常皮膚CK10表達(dá)具有一定差異(P<0.05)，CK10表達(dá)增強(qiáng)，見表1。

3 討論

黃褐斑在亞洲人種中發(fā)病率很高，目前黃褐斑的治療仍存在一定困難[4]，主要由于黃褐斑的病因尚不清楚，關(guān)于黃褐斑的病理改變也存在很多爭議，具體有:①一般認(rèn)為黃褐斑的表皮層黑素含量增加，但黑素細(xì)胞數(shù)目是否有增加存在爭議;②一般認(rèn)為黃褐斑位于表皮層，是以表皮為主的皮膚內(nèi)黑色素增多，但是否存在真皮型黃褐斑也有爭議[5]。最新的黃褐斑診斷分類標(biāo)準(zhǔn)也只有按照部位和病因分類，無病理分類[2]。國內(nèi)對(duì)黃褐斑的研究文獻(xiàn)大多以治療效果評(píng)價(jià)為主，少數(shù)學(xué)者研究了諸如干細(xì)胞因子及其配體c-kit受體的表達(dá)情況[6]。因此進(jìn)一步研究黃褐斑的病理改變是有意義的。

黃褐斑的形成既有內(nèi)在因素，又有外界因素。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，黃褐斑的發(fā)生部位多為顴頰部，此處暴露突出，皮膚薄，皮下脂肪少，易受到外界環(huán)境的侵害，容易發(fā)生皮膚老化和形成色斑。我們的病理切片結(jié)果表明，黃褐斑皮損表皮薄，皮膚附件和皮下脂肪少，所以較易干燥，皮膚老化較快，角質(zhì)層明顯增厚。色素顆粒由黑素細(xì)胞合成，黃褐斑患者基底層黑素顆粒增多[7]，黑素顆粒通過黑素細(xì)胞樹突進(jìn)入角質(zhì)細(xì)胞后像傘樣或者帽樣覆蓋于細(xì)胞核頂上方，保護(hù)細(xì)胞核免受紫外線輻射損傷。因此，黃褐斑的生成除了內(nèi)分泌因素之外，也可能是身體抵抗外界侵害的一種自我保護(hù)機(jī)制。

角蛋白是上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白和主要蛋白，直徑約為10nm左右，它在細(xì)胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。角蛋白的分子量為40～68KD，隨著細(xì)胞的分化程度增高，細(xì)胞表達(dá)的角蛋白的分子量也隨著增加。研究表明，細(xì)胞角蛋白與很多遺傳性皮膚病密切相關(guān)[8]，如銀屑病、魚鱗病、表皮松解癥和毛囊角化癥等[9]。一般認(rèn)為CK1和CK10等分子量較大的為分化相關(guān)角蛋白[10]，主要表達(dá)于有絲分裂后期的基層上細(xì)胞，在細(xì)胞增殖活躍的情況下如腫瘤、創(chuàng)傷下CK10表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)研究表明CK10抑制腫瘤形成和細(xì)胞增殖的能力源于它具有獨(dú)特的N末端和C末端，因此CK10不僅是作為細(xì)胞骨架的中間絲結(jié)構(gòu)，而且還影響表皮細(xì)胞的腫瘤易感性[11]。黃褐斑的發(fā)生也具有某些遺傳因素，黑素顆粒的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)受到眾多蛋白的調(diào)節(jié)[12]。黑素進(jìn)入角質(zhì)細(xì)胞后會(huì)隨著角質(zhì)細(xì)胞分化脫落而逐漸排出體外。我們的免疫組化結(jié)果顯示黃褐斑皮膚基底上層和皮脂腺腺泡的最外層中高表達(dá)CK10，表明黃褐斑皮膚細(xì)胞分化程度高，表皮細(xì)胞代謝加快并逐漸老化。

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[收稿日期]2010-04-22[修回日期]2010-07-30

編輯/李陽利