摘要：為保存野生根莖大的澤瀉種質(zhì)，以根莖為材料，成功地建立起澤瀉無(wú)性系。結(jié)果證明：MS+BA0.3mg／L+NH₄H₂PO₄50mg／L+2.4－D1.6～2.0mg／L是愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基MS+NAA 0.1mg／L+AgNO₃0.5mg／L+GA₃ 1.0mg／L+BA 0.9mg／L是愈傷組織分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基；1／2MS+IAA 0.2 mg／L+NAA 0.1 mg／L的液體培養(yǎng)基是澤瀉不定芽生根培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基；在溫室中試管苗易移栽成活，移植到材料原產(chǎn)地的試管苗生長(zhǎng)旺盛，保持了根莖大的性狀。

關(guān)鍵詞：澤瀉；組織培養(yǎng)；無(wú)性系

中圖分類號(hào)：S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942(2010)07-0005-03

澤瀉(Alisma orientale)又稱水瀉、芒芋、澤芝，屬澤瀉科澤瀉屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于沼澤或人工栽培，我國(guó)的大部分地區(qū)有分布。澤瀉的根莖中含澤瀉醇等三萜類成分，具有利濕滲水、泄熱通淋等功效，能治小便不利、水腫脹滿、痰飲眩暈、泄瀉和遺精等癥狀。其果實(shí)與葉也能人藥，具有益腎氣、通血脈、逐水等功效。近年來(lái)我國(guó)也多有觀賞栽培。北方野生澤瀉根莖一般很小，偶爾也會(huì)發(fā)現(xiàn)根莖較大植株，但通過(guò)種子繁殖的實(shí)生苗，后代無(wú)法保持根莖較大的性狀。為此，筆者對(duì)根莖較大的野生澤瀉植株進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，以期使優(yōu)良野生澤瀉種質(zhì)得到保存和有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

以大連市金州區(qū)大魏家河邊生長(zhǎng)旺盛、根莖大的澤瀉為材料。

1.2 材料滅菌

于5月下旬將生長(zhǎng)旺盛、根莖大的澤瀉挖回栽到溫室的花盆中，然后放到盛水的花盆中，使花盆的下部完全浸在水中。待澤瀉完全恢復(fù)正常生長(zhǎng)后，將下面花盆中的水換成0.001％的HgCl₂溶液，處理5d。然后將植株挖出，剪掉葉和須根，用清水洗凈后放入磨口廣口瓶中，用蒸餾水洗凈。將其移到超凈工作臺(tái)上，用70％乙醇滅菌約10s，然后用0.025％的HgCl₂溶液振蕩滅菌14min左右，最后用無(wú)菌水反復(fù)振蕩洗滌，即可獲得無(wú)菌根莖。

1.3 培養(yǎng)條件

參見(jiàn)李肖依等(2008)萍蓬草的組織培養(yǎng)及研究。

1.4 方法

1.4.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將無(wú)菌根莖放到具有吸水紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中吸干表面殘留液，用解剖刀切成0.2～0.3cm的塊狀，接種到以MS+BA0.3m／L(以下單位相同者略)+NH₄H₂PO₄50為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4－D和IAA(見(jiàn)表1)，26℃暗培養(yǎng)。每種處理接種20塊根莖。

1.4.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)把暗培養(yǎng)獲得的愈傷組織在無(wú)菌培養(yǎng)皿中分散為獨(dú)立的球狀后，接種到與愈傷組織誘導(dǎo)成分相同的培養(yǎng)基上，光照、26℃恒溫條件下進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)。每種處理接種100個(gè)材料，重復(fù)3次(以下試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和處理材料相同者略)，1次試驗(yàn)繼代培養(yǎng)4代。

1.4.3 愈傷組織的分化培養(yǎng)把繼代培養(yǎng)的愈傷組織分散為獨(dú)立的顆粒后，接種到添加不同濃度細(xì)胞分裂素BA和KT(見(jiàn)表2)的MS+NAA0.1+AgNO₃0.5+GA31.0培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)。

1.4.4不定芽生根培養(yǎng)在MS+NAA 0.1+AgNO₃0.5+GA₃1.0+BA0.9培養(yǎng)基上培養(yǎng)到45 d，分化不定芽高1cm以上、具有5～7個(gè)葉片時(shí)，將其從基部切下，分別接種到三種深度約為0.3cm的1／2MS+IAA 0.2+NAA 0.1、1／2MS+IAA 0.2+NAA 0.3、1／2MS+IAA 0.2+NAA 0.6液體培養(yǎng)基上，接種的不定芽?jī)A倒在培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的生根培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.4.5 試管苗移栽把在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的試管苗移栽到下面和四周鋪著塑料膜、下部為園土、上部為1～2cm水層的溫室水床中。移栽后的前7～10d，水床上面搭遮陰網(wǎng)，防止直射光照射。移栽試驗(yàn)進(jìn)行2次，移栽數(shù)量分別為400、600株。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)到15d左右，部分培養(yǎng)材料可觀察到邊緣膨大，隨后不斷生長(zhǎng)，至70d時(shí)統(tǒng)計(jì)。由表1可見(jiàn)，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的IAA，不能誘導(dǎo)形成愈傷組織；加入2，4－D能夠誘導(dǎo)形成愈傷組織，但其濃度不同，出愈率和長(zhǎng)勢(shì)不同。2，4－D濃度為1.6、2.0時(shí)，不僅出愈率達(dá)到了95％、90％，而且所誘導(dǎo)的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好。觀察還表明，在含上述兩種濃度2，4－D的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生長(zhǎng)的愈傷組織初期近透明狀，后來(lái)漸漸變成了黃色的不等球狀。這說(shuō)明MS+BA 0.3+NH₄H₂PO₂50+2，4－D 1.6～2.0的培養(yǎng)基是澤瀉根莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)50d的結(jié)果證明：在光照、恒溫條件下繼代培養(yǎng)的愈傷組織生長(zhǎng)速度加快，50d的繁殖系數(shù)為9.6，并且所培養(yǎng)的愈傷組織為連接較為疏松的綠色顆粒狀。這也說(shuō)明澤瀉根莖愈傷組織繼代培養(yǎng)與誘導(dǎo)培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基相同。

2.3 不同濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

觀察表明，分化培養(yǎng)15d左右，部分愈傷組織出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，隨后逐漸生長(zhǎng)為不定芽，并在已經(jīng)分化形成的不定芽基部又會(huì)陸續(xù)分化出多個(gè)不定芽。培養(yǎng)到45d時(shí)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)，在添加不同濃度BA的培養(yǎng)基上都能分化，但其濃度不同，分化生長(zhǎng)的結(jié)果有別。在11號(hào)培養(yǎng)基上，不僅分化率最高，分化不定芽長(zhǎng)勢(shì)好，而且平均分化不定芽的數(shù)量最多。這說(shuō)明MS+NAA0.1+AgNo₃ 0.5+GA₃ 1.0+BA 0.9的培養(yǎng)基是澤瀉愈傷組織分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.4 不同生長(zhǎng)素組合對(duì)生根培養(yǎng)的影響

接種培養(yǎng)25d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果證明：在1／2MS+IAA 0.2+NAA 0.1培養(yǎng)基上，不定芽生根率為98％，試管苗根系發(fā)達(dá)，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。觀察表明，在這種液體培養(yǎng)基上，接種5d左右，傾倒在培養(yǎng)基中的不定芽頂部向上彎著生長(zhǎng)，接種7d左右，可見(jiàn)形成根原基。初期形成的根為白色，后逐漸變成綠色。這說(shuō)明1／2MS+IAA 0.2+NAA 0.1是澤瀉不定芽生根培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.5 試管苗移栽與移植

移栽后20d統(tǒng)計(jì)證明：2次移栽的平均成活率為99.25％。觀察表明，移栽的試管苗前期生長(zhǎng)較慢，植株較小，50d后生長(zhǎng)加速，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。將在溫室內(nèi)移栽成活的試管苗移植到研究材料原產(chǎn)地的河邊上，試管苗不僅保持了根莖大的性狀，而且長(zhǎng)勢(shì)較野生植株旺盛。

3 結(jié)論與討論

雖然國(guó)內(nèi)目前已有許多植物組織培養(yǎng)研究的報(bào)道，包括澤瀉組織培養(yǎng)研究的報(bào)道，但迄今未見(jiàn)澤瀉根莖無(wú)性系研究的報(bào)道。本研究以澤瀉的根莖為材料，成功地建立起野生澤瀉無(wú)性系，不僅使少數(shù)根莖較大野生植株的有利性狀得到應(yīng)用，也可使野生優(yōu)良植株的種質(zhì)得到保存。

在本研究中，采用愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法，50d的繁殖系數(shù)為9.6。按照這個(gè)繁殖速度，每年能繁殖9.6個(gè)后代，完全可滿足研究或栽培對(duì)大量種苗的需求。

在添加一定濃度2，4－D培養(yǎng)基上，能誘導(dǎo)澤瀉的根莖形成愈傷組織。這個(gè)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，也證明在進(jìn)行植物的愈傷組織誘導(dǎo)研究中，2，4－D具有較強(qiáng)的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國(guó)科學(xué)院植物研究所主編.中國(guó)高等植物圖鑒(第五冊(cè))[M].北京：科學(xué)出版社，1980，17.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué)編著.中藥大辭典(上冊(cè))[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006，2065—2068.

[3]北京林業(yè)大學(xué)園林系花卉教研組著.花卉學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1990，413—414.

[4]李書(shū)心主編.遼寧植物志(下冊(cè))[M].沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1991，640—641.

[5]李肖依，趙娜，王宇，等.萍蓬草的組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究[J].科技信息。2008.29：45—46.