摘要：通過RT－PCR擴增得到了黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV)山東泰安南瓜分離物(CGMMV－TANG)的外殼蛋白基因，經過序列分析，該分離物外殼蛋白(CP)基因全長486個核苷酸，由161個氨基酸組成。對CP基因核苷酸序列進行同源性比較和構建系統(tǒng)進化樹，并結合寄主來源及地域來源進行分析，結果表明該病毒的不同分離物在分組上與地域有一定的關系。

關鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)；核苷酸序列；外殼蛋白基因；序列分析

中圖分類號：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)07-0001-04

黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamouirus)成員，最早由Ainsworth 報道。它主要分布在日本、印度、英國等歐洲和亞洲的國家和地區(qū)，是許多國家和地區(qū)重要的檢疫性病毒之一，嚴重威脅著西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物的生產，一般減產約15％。近幾年在我國不同地區(qū)陸續(xù)發(fā)現，屬我國潛在危險性有害生物。自從2004年廈門檢驗檢疫局首次從進口的日本番木瓜種子中截獲CGMMV以來，它相繼在河北、甘肅、北京、遼寧等地區(qū)發(fā)生為害，2005年僅遼寧省蓋州市西瓜感染CGMMV的面積為333hm²，其中13hm²絕收。為此，農業(yè)部發(fā)布了第788號公告，將其確定為全國農業(yè)植物檢疫性有害生物。因此，加強對該病毒的認識、檢測和防疫控制尤為重要。本研究采用RT－PCR的方法，從山東泰安南瓜樣品中檢測到了CGM-MV病毒，并對其外殼蛋白(CP)基因序列進行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

感染CGMMV的南瓜病株采自山東泰安田間；Transzol、M-MLV、RNase Inhibitor和TaqE等由北京全式金公司提供；克隆載體pMD18-T和內切酶等購自TaKaRa公司。

1.2 RNA提取和RT－PCR擴增

采用Transzol法直接提取病葉總RNA為模板，以CGMMV的3′端引物G1－3：5′－TGGGC－CCCTACCCGGGGAAAAG－3′進行反轉錄。以5端引物C1－5：5′－ATGGCTrACAATCCGATCAC－3′及配對引物G1－3進行PCR擴增，所用程序：94℃3min；94℃55s，55℃55s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。］

1.3 PCR產物的克隆、測序及序列分析

PCR產物回收后與pMDl8－T連接，然后轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，提純質粒進行PCR及酶切鑒定。將重組質粒送上海博亞有限公司測序。在GenBank中對所得序列進行BLAST檢索；采用DNAMAN、DNAstar等軟件進行核苷酸和氨基酸序列的分析，利用MEGA4.1構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 RT－PCR擴增結果

將RT－PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小700bp左右的片段(圖1)，測序結果經BLAST檢索顯示，南瓜上的分離物為CGMMV。

2.2 CP基因的序列分析

對擴增產物進行序列分析，結果表明所得目的片段長度與預期結果一致，為667bp，包含了完整CP基因，共486個核苷酸，編碼161個氨基酸(圖2)，與已報道的其它CGMMV分離物相同，命名為CGMMV－TANG(GenBank登錄號：GQ500898)。核苷酸同源性比較表明：與遼寧西瓜分離物(EF611826)的核苷酸同源性最高，達99.6％，與西班牙黃瓜分離物(GQ411361)同源性最低為91.6％。

2.3 同源性與系統(tǒng)進化樹分析

在GenBank上選擇不同地區(qū)不同寄主上的CGMMV分離物及CGMMV－TANG共21個，對這些分離物CP基因的核苷酸序列進行同源性比較發(fā)現，彼此之間的核苷酸序列非常相似，平均同源性為96.9％。CGMMV－TANG與其他分離物的同源性為91.6％～99.6％，氨基酸的同源性為98.5％～100％。以AB162006(Kyuri Green Mot-tle Mosaic Vires，KGMMV)為外組，對這21個分離物CP基因的核苷酸序列進行系統(tǒng)進化樹(圖3)分析，表明：KGMMV與CGMMV分離物各自獨立為一枝，而CGMMV分離物可以歸類到2個進化相關組I、Ⅱ中。I組主要包括了來自中國大陸、臺灣、日本、韓國、法國以及希臘的15個分離物，CGMMV－TANG位于第1組內；通過核苷酸序列同源性比較發(fā)現I組內分離物的同源性為97.3％～99.6％；I組與Ⅱ組的同源性為90.6％～92.6％。Ⅱ組包括了來自希臘、西班牙、俄羅斯的6個歐洲分離物，他們之間的同源性為95.7％～100％。

3 討論

黃瓜綠斑駁花葉病毒是為害葫蘆科植物的重要病毒之一，自2004年以來有關其危害的報道不斷。2005年廣西農業(yè)科學院從廣西某農業(yè)展示中心觀賞南瓜的葉片上分離到了CGMMV；2006年陳紅運等從遼寧西瓜上檢測到CGM—MV；2007年李紅霞等在甘肅南瓜果實中檢測到CGMMV；2009年田永蕾等在北京甜瓜及山東西瓜上檢測到CGMMV。本研究首次在山東田間的南瓜上分離到該病毒，并從CP核苷酸序列水平上分析了不同分離物與寄主來源及地域來源的關系，通過分析由21個分離物CP基因的核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹，表明CGMMV分離物可歸為兩組，I組除了一個法國的分離物(AJ429090)和一個希臘的分離物(AJ459423)外均為亞洲的分離物，而Ⅱ組都為歐洲的分離物，說明CGMMV不同分離物的基因組變異表現出一定的地域相關性，這與張永江等(2008)報道的結果不一致，但不同分離物基因組變異與寄主種類沒有關聯(lián)。通過系統(tǒng)進化樹可以看出I、Ⅱ組又可各自分為3個不同的亞組，CGMMV－TANG位于亞組I中。序列比對發(fā)現與之同源性最高的為中國遼寧的分離物(EF611826)，為99.6％；其次為韓國的分離物(AF417243)和日本的分離物(D12505)，都為99.4％，說明了CGMMV—TANG與日、韓報道的CGMMV有共同的流行學意義上的侵染源，進一步驗證了我國的CGMMV可能由國外引種傳人的論斷。Ⅱ組中3個亞組的分離物分別來自希臘、西班牙以及俄羅斯等歐洲國家，進一步說明它們在地域上存在一定的相關性。

目前國內對傳人的CGMMV起源與進化研究較少，在CGMMV全基因組核苷酸序列范圍內進行同源性比較可能會更好地確定CGMMV基因組結構是否因地域不同而發(fā)生變化，這些方面的內容還需要進一步研究。