王更亮,許傳營,王廣東

花燭 (AnthuriumandraeanumL ind.)又名紅掌、安祖花,為天南星科 (A raceae)花燭屬 (AnthuriumSchott)多年生常綠草本植物[1],因其花型獨特、花色艷麗、周年開花而備受人們喜愛,是具有較高觀賞和經(jīng)濟價值的花卉之一?；T屬植物種類豐富(約 550余種),且經(jīng)過長期的種間雜交已培育出大量栽培品種,截至 20世紀 90年代已培育出 100余個優(yōu)良的花燭栽培品種[2]。目前,花燭種質資源的保存主要采用傳統(tǒng)的田間資源圃和組織培養(yǎng)保存法。傳統(tǒng)的種質資源保存方法不僅需要大量的人力、物力及土地,還受到栽培環(huán)境的影響,在保存過程中易發(fā)生變異進而導致花燭種性退化和丟失,最終影響優(yōu)良種質資源的利用。因此,建立一種操作簡便并能長期穩(wěn)定保存花燭種質資源的方法至關重要。

超低溫保存是植物種質資源保存的有效方法之一。常規(guī)超低溫保存多采用兩步法,但需要程序降溫儀等專業(yè)設備,且保存效果不穩(wěn)定、存活率低,不同種類間的保存效果存在差異,在實際應用過程中存在較多問題[3]。玻璃化超低溫保存技術則克服了上述缺點,植物材料經(jīng)冷凍保護劑處理后可以直接于液氮中保存,無論是成本還是凍后存活率均有較大改進,是目前植物種質資源長期保存最為有效而簡便的方法,具有較廣的應用前景[4]。目前采用玻璃化超低溫保存法已成功保存了荔枝 (LitchichinensisSonn.)[5]、枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.)L ind l.〕[6]及長鞭紅景天〔Rhodiolafastigiata(Hook.f.et Thom s.)S.H. Fu〕[7]等多種植物的懸浮細胞系。

在已獲得花燭胚性懸浮細胞培養(yǎng)體系的基礎上,作者對花燭胚性懸浮細胞的玻璃化超低溫保存條件(包括繼代培養(yǎng)時間、滲透調節(jié)劑種類和濃度及預培養(yǎng)時間、裝載液種類和預處理時間、冷凍保護劑 PVS2脫水時間和超低溫保存后的化凍溫度)進行了比較研究,篩選出適宜的保存條件,以期為花燭種質資源的長期保存提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以花燭品種‘Am igo’葉片為外植體,采用辛偉杰等[8]的方法誘導形成胚性愈傷組織；將胚性愈傷組織接種于 250 m L三角瓶中,參照文獻[9]的液體培養(yǎng)方法進行增殖培養(yǎng)；用機械方法將增殖狀態(tài)良好的胚性愈傷組織細胞團破碎成顆粒狀,網(wǎng)篩過濾,篩選出2mm的懸浮細胞團作為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)流程 選取繼代培養(yǎng) 3 d的直徑2mm的花燭胚性懸浮細胞團 (0.2 g),用 1/2M S液體培養(yǎng)基 (含 80 g·L-1蔗糖,pH 5.8)預培養(yǎng) 2 d后,置于 4℃冰箱中低溫處理 24 h；參照 Sakai等[10]的配方配制裝載液 PVS2,在室溫條件下用體積分數(shù) 25％的 PVS2預處理 10m in,然后用預冷至 0℃的體積分數(shù)100％的 PVS2在0℃條件下脫水 7.5m in,隨即投入液氮中冷凍保存；凍存 6 h后,將細胞團置于 37℃水浴中化凍。

化凍后,迅速移除 PVS2,室溫條件下用 1/2M S液體培養(yǎng)基 (含 1.2mo l·L-1蔗糖,pH 5.8)將細胞洗滌 3次,每次 10m in,然后將細胞首先轉移到含80 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基 (pH 5.8)中,置于 25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 3 d后,轉到含 40 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基(pH 5.8)中繼續(xù)暗培養(yǎng) 2 d,最后轉移至正常液體繼代培養(yǎng)基(含 1.0m g·L-12, 4-D、0.5m g·L-1KT和 30 g·L-1蔗糖的 1/2M S培養(yǎng)基,pH 5.5)中振蕩培養(yǎng),轉速為 100 r·m in-1,散射光,培養(yǎng)溫度 25℃～28℃?；謴团囵B(yǎng) 5 d后測定細胞的相對存活率。

1.2.2 單因素實驗設計 在預實驗基礎上,采取逐步優(yōu)化方法對影響超低溫保存效果的各種因素 (包括繼代培養(yǎng)時間、滲透調節(jié)劑的種類和濃度及預培養(yǎng)時間、裝載液種類及預處理時間、PVS2脫水時間和化凍溫度)進行單因子實驗,除對待優(yōu)化因素進行不同設置外,其他條件均與基本培養(yǎng)流程相同。

繼代培養(yǎng)時間設置 5個處理：1、3、5、7和 9 d；預培養(yǎng)過程中的滲透調節(jié)劑分別為蔗糖和山梨醇,蔗糖質量濃度設置 4個梯度：60、80、100和 120 g·L-1,山梨醇濃度設置 3個梯度：0.3、0.5和 0.7 mo l· L-1,二者均分別設置 5個預培養(yǎng)時間：0、1、2、3和 4 d；預處理中使用的裝載液分別為體積分數(shù) 25％、60％和 80％的 PVS2以及混合液 (包含 2mo l·L-1甘油和 0.4mo l·L-1蔗糖),處理時間分別設置為 0、5、10、15和20 m in；用體積分數(shù)100％PVS2脫水的時間設置 7個處理：0、5、10、15、20、25和 30 m in；化凍溫度設置 6個處理：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃。各處理的懸浮細胞團用量均為 0. 2 g,各 3次重復。

1.2.3 細胞活力測定 采用氯化三苯四氮唑(TTC)法檢測恢復培養(yǎng) 5 d后花燭胚性懸浮細胞的細胞活力,用吸收值 (TTC值)表示超低溫保存后細胞的存活率[11-12],并據(jù)此計算細胞的相對存活率,計算公式為：細胞相對存活率 =(處理后細胞的 TTC值/未處理細胞的 TTC值)×100％。

2 結果和分析

2.1 繼代培養(yǎng)時間對懸浮細胞相對存活率的影響

對于玻璃化超低溫保存技術來說,保存材料的生理狀態(tài)與其抗寒性、耐干燥及脫水能力有關,是影響玻璃化超低溫保存效果的重要因素之一。繼代培養(yǎng)時間不同的花燭懸浮細胞經(jīng)玻璃化超低溫保存后的相對存活率見表 1。由表 1可看出,繼代培養(yǎng) 1 d的花燭懸浮細胞經(jīng)冷凍保存后的相對存活率較低,僅為13.5％；繼代培養(yǎng)時間延長,細胞相對存活率也逐漸提高,細胞的抗凍能力有所增強。繼代培養(yǎng) 3 d的懸浮細胞相對存活率最高,達到 20.4％；繼代培養(yǎng) 5 d的細胞相對存活率也較高,為 19.7％。繼代培養(yǎng)時間超過 5 d后,隨繼代培養(yǎng)時間的進一步延長,懸浮細胞的相對存活率呈下降趨勢,繼代培養(yǎng) 9 d的花燭懸浮細胞的相對存活率最低,僅為 8.7％,細胞的抗凍能力最差。造成這一現(xiàn)象的原因可能是培養(yǎng) 3～5 d的懸浮細胞正處于指數(shù)生長期,處于此時期的細胞凍存后能保持分裂能力的細胞占有較高比例,并且大部分細胞體積較小、細胞質較濃、細胞壁較薄、無液泡,比具有液泡或細胞壁較厚的懸浮細胞更耐凍。差異顯著性分析結果表明,經(jīng)冷凍保存后,繼代培養(yǎng)3和 5 d的懸浮細胞的相對存活率極顯著高于繼代培養(yǎng)1、7和 9 d的懸浮細胞(P＜0.01),因而,繼代培養(yǎng)3～5 d的花燭胚性懸浮細胞是玻璃化超低溫保存的理想材料。

表 1 不同繼代培養(yǎng)時間對玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞相對存活率的影響1)Tab le 1 Effect of d ifferen t subcu lture tim es on rela tive surv iva l ra te of em bryon ic suspen sion cells of An thu rium and raeanum L ind.after v itr ifica tion cryopreserva tion1)

2.2 滲透調節(jié)劑對懸浮細胞相對存活率的影響

用含不同滲透調節(jié)劑 (蔗糖和山梨醇)的 1/2M S液體培養(yǎng)基對繼代培養(yǎng) 3 d的花燭胚性懸浮細胞進行不同時間的預培養(yǎng),懸浮細胞的相對存活率見表2。結果表明,未經(jīng)預培養(yǎng)的懸浮細胞活性極低,抗凍能力較弱,恢復培養(yǎng)后的生長狀態(tài)較差,細胞相對存活率僅約 5％；而用含有不同質量濃度蔗糖或山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)的懸浮細胞活性明顯增強,細胞相對存活率顯著增加,但預培養(yǎng)超過一定時間后,相對存活率開始下降?？傮w來說,經(jīng)含有不同濃度蔗糖或山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng) 2 d,懸浮細胞的抗凍能力最強,相對存活率最高。

2.2.1 蔗糖的影響效應 由表 2可見,用含有不同質量濃度蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基對花燭懸浮細胞進行預培養(yǎng),經(jīng)過玻璃化超低溫冷凍保存后花燭懸浮細胞的相對存活率有一定的波動。用含 80 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)的懸浮細胞相對存活率大幅度增加,用含 100 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)的花燭懸浮細胞相對存活率較高,而用含 120 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)的懸浮細胞相對存活率則有所降低。

表 2 滲透調節(jié)劑和預培養(yǎng)時間對玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞相對存活率的影響Tab le 2 Effectsof osm otic regu la ting agen tsand pre-cu lture tim e on rela tive surv iva l ra te of An thu rium andraeanum L ind.em bryon ic suspen sion cellsafter v itr ifica tion cryopreserva tion

在蔗糖質量濃度相同的條件下,延長預培養(yǎng)時間,各處理組懸浮細胞的相對存活率并不因預培養(yǎng)時間的延長而增加,預培養(yǎng) 2或 3 d的懸浮細胞相對存活率最高,超過適宜的預培養(yǎng)時間,各處理組花燭懸浮細胞的相對存活率均下降。用含 60 g·L-1蔗糖的1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng) 3 d,懸浮細胞的相對存活率最高；分別用含 80和 100 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng) 2 d,懸浮細胞的相對存活率最高；而用含 120 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)1 d,懸浮細胞的相對存活率即達到最大值。這可能是由于蔗糖質量濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長均可導致細胞過度脫水,產(chǎn)生滲透脅迫,不利于花燭懸浮細胞的生長。實驗結果表明,用含 100 g·L-1蔗糖的1/2M S液體培養(yǎng)基預培養(yǎng) 2 d,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后,花燭胚性懸浮細胞恢復活力的效果較好。

2.2.2 山梨醇的影響效應 由表 2還可看出,預培養(yǎng)基中添加的山梨醇濃度與預培養(yǎng)時間對經(jīng)過玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞的相對存活率也有較大影響。預培養(yǎng)時間相同,花燭懸浮細胞的相對存活率隨山梨醇濃度的提高表現(xiàn)出一定的波動變化趨勢,其中,用含 0.5 mo l·L-1山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基進行預培養(yǎng),懸浮細胞的相對存活率最高。

在山梨醇濃度相同的條件下,延長預培養(yǎng)時間,花燭懸浮細胞的相對存活率并不因預培養(yǎng)時間的延長而提高,而是在適宜預培養(yǎng)時間達到最高,超過該時間則降低。經(jīng)過 2 d的預培養(yǎng),在玻璃化超低溫保存后花燭懸浮細胞的相對存活率均最高。

綜合分析后可看出,以山梨醇作為滲透調節(jié)劑對花燭懸浮細胞進行預培養(yǎng),經(jīng)玻璃化超低溫保存后懸浮細胞的相對存活率優(yōu)于以蔗糖作為滲透調節(jié)劑進行預培養(yǎng)的細胞,最高可達 26.2％。因而,在花燭懸浮細胞玻璃化超低溫保存過程中,適宜的預培養(yǎng)基為含 0.5mol·L-1山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基,最佳預培養(yǎng)時間為2 d。

2.3 裝載液預處理對懸浮細胞相對存活率的影響

用不同裝載液對花燭胚性懸浮細胞進行不同時間的預處理,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后懸浮細胞的相對存活率見圖 1。由圖 1可見,未經(jīng)裝載液預處理的懸浮細胞經(jīng)玻璃化超低溫保存后的相對存活率較低。而用裝載液預處理不同時間,經(jīng)玻璃化超低溫保存后懸浮細胞的相對存活率有一定的差異,基本變化趨勢是在一定時間內預處理時間越長懸浮細胞的相對存活率越高,但超過適宜預處理時間,懸浮細胞的相對存活率則降低,這可能是由于預處理時間過長,裝載液則對懸浮細胞產(chǎn)生毒害作用,致使懸浮細胞的相對存活率下降。

圖 1 裝載液種類及預處理時間對玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞相對存活率的影響F ig.1 Effects of load ing solution types and pre-trea tm en t tim e on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum Lind.em bryon ic suspen sion cellsa fter v itr ifica tion cryop reserva tion

用不同裝載液對懸浮細胞進行相同時間的預處理,懸浮細胞的相對存活率有一定的差異,其中,用體積分數(shù) 25％PVS2處理 15 m in,經(jīng)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞的相對存活率最高,達到29.0％。因此,用裝載液對花燭懸浮細胞預處理的最適條件為用體積分數(shù) 25％PVS2室溫預處理 15m in。

2.4 脫水時間對懸浮細胞相對存活率的影響

以體積分數(shù) 100％PVS2為冷凍保護劑,對花燭胚性懸浮細胞進行不同時間的脫水處理,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后懸浮細胞的相對存活率見圖 2。結果表明,未經(jīng)體積分數(shù) 100％PVS2脫水處理的懸浮細胞相對存活率較低,僅為 7.7％；用體積分數(shù) 100％PVS2處理 10 m in的胚性懸浮細胞相對存活率最高,達到32.1％；處理時間超過 10 m in,懸浮細胞相對存活率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因為處理時間低于 10m in,細胞脫水不充分,在降溫過程中不能迅速達到玻璃化狀態(tài),因而不易成活；而處理時間超過 10m in,細胞受到 PVS2的毒害作用,相對存活率也有所下降。

圖2 體積分數(shù)100％PVS2處理不同時間對玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞相對存活率的影響F ig.2 Effect of d ifferen t trea tm en t tim es of 100％PVS2 on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum L ind.em bryon ic suspen sion cellsafter v itr ifica tion cryopreserva tion

2.5 化凍溫度對懸浮細胞相對存活率的影響

經(jīng)過玻璃化超低溫保存后再用不同溫度水浴化凍,花燭胚性懸浮細胞的相對存活率見圖 3。結果表明,化凍溫度低,懸浮細胞的相對存活率也較低；化凍溫度為 40℃,懸浮細胞的相對存活率最高,達到32.1％；化凍溫度超過 40℃,懸浮細胞的相對存活率則逐漸下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能是因為化凍溫度過低時細胞易發(fā)生次生結冰現(xiàn)象,致使細胞受到傷害；而化凍溫度過高又易使懸浮細胞受到化學毒害。所以,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞水浴化凍的最適溫度為 40℃。

圖 3 化凍溫度對玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細胞相對存活率的影響F ig.3 Effect of thaw ing tem pera ture on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum Lind.em bryonicsuspen sioncells a fter v itr ifica tion cryopreserva tion

3 討論和結論

通過上述實驗,對花燭胚性懸浮細胞玻璃化超低溫保存過程中各步驟的適宜條件進行了比較分析,初步建立的適宜于花燭品種‘Am igo’胚性懸浮細胞玻璃化超低溫保存和化凍流程為：將繼代培養(yǎng) 3～5 d、直徑 2mm的懸浮細胞團在含 0.5mo l·L-1山梨醇的1/2M S液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) 2 d后,置于 4℃條件下處理 24 h,然后用體積分數(shù) 25％PVS2預處理15m in,再于 0℃條件下用體積分數(shù) 100％PVS2脫水10m in,迅速投入液氮中凍存；凍存后的懸浮細胞在40℃水浴中化凍 3m in,然后用含 1.2mo l·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基洗滌 3次,每次 10m in,洗滌后的懸浮細胞即可轉至恢復培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)。

實驗結果顯示,細胞的生理狀態(tài)、預培養(yǎng)、預處理和脫水處理是決定花燭胚性懸浮細胞玻璃化超低溫保存能否成功的重要因素。其中,預培養(yǎng)可以減少細胞內的自由水含量,提高細胞的束縛水含量,增強細胞抗凍性。此外,用適宜濃度的山梨醇進行預培養(yǎng),其效果優(yōu)于蔗糖,這可能與“在液體培養(yǎng)基中添加山梨醇可以極大地降低冰晶的形成溫度和形成速率”[13]有關。

花燭懸浮細胞的含水量較大,預培養(yǎng)后仍需經(jīng)過脫水處理以降低細胞內的含水量,而用高濃度冷凍保護劑直接進行脫水容易對細胞造成物理和化學毒害,因此,如何減少高濃度冷凍保護劑對細胞的傷害是玻璃化超低溫保存成功與否的關鍵[14]。研究結果表明,在用冷凍保護劑脫水前采用低濃度保護劑進行預處理,可以獲得較好的效果。可能的原因是在急速脫水前用冷凍保護劑進行預處理具有一定的緩沖效果,減輕了劇烈脫水對細胞的傷害,保持了細胞膜的完整性[15-16]；預處理后的懸浮細胞再經(jīng)脫水處理,可以進一步降低細胞含水量,促進低溫時玻璃化狀態(tài)的形成,從而減少冰晶形成過程中對細胞膜造成的傷害[17]。但關于預處理的作用機制目前尚未見相關報道。

一般來說,保存材料在高濃度糖中長期培養(yǎng)會產(chǎn)生高滲傷害,懸浮細胞長時間浸于玻璃化溶液中也會造成脫水過度,因此保存材料的耐脅迫性及適宜的處理時間對植物懸浮細胞玻璃化超低溫保存至關重要[18]。而保存材料對環(huán)境脅迫的耐受能力與植物的基因型以及不同階段的生理狀態(tài)等因素有關[17],尤其是對不耐寒的熱帶和亞熱帶植物進行玻璃化超低溫保存時,更應選擇生理狀態(tài)最佳的材料。

超低溫保存過程中,保存材料在液氮中保存時間的長短對保存效果影響較小,例如：保存 1 d和保存10個月的櫻桃〔Cerasuspseudocerasus(L ind l.)G. Don〕在保存效果上無明顯區(qū)別[19]。目前,多采用35℃～40℃水浴對超低溫保存材料進行化凍,花燭胚性懸浮細胞玻璃化超低溫保存后需要經(jīng)過 40℃水浴快速化凍才能保持較高的相對存活率,但木本植物的冬芽超低溫保存后必須在 0℃低溫下慢速化凍才能達到最好的效果[20]。可見,冷凍保存的植物種類不同,其化凍溫度也不同。

值得注意的是,恢復生長后花燭胚性懸浮細胞的實際再生率低于用 TTC法檢測的懸浮細胞的相對存活率。一方面可能是由于 TTC法檢測是以脫氫酶的活力為標準,不能完全反映保存材料經(jīng)超低溫處理后的損傷程度；另一方面也可能是在超低溫保存后細胞未達到恢復生長的要求。此外,超低溫保存后保存材料的再生能力也可能與植物本身的抗寒性有關,因此,不同品種花燭胚性懸浮細胞的適宜保存條件有一定的差異,應分別進行進一步的深入研究。

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