孫小芹，郭建林，周義鋒，彭 斌，白明明，杭悅宇

〔江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園）江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014〕

叉蕊薯蕷（DioscoreacollettiiHook.f.）為薯蕷科（Diosco reaceae）薯蕷屬（DioscoreaL.）根狀莖組（Sect.Stenophora）植物，為中國特有種之一，主要分布在長江以南各省區(qū)。據(jù)文獻(xiàn)[1-2]記載，叉蕊薯蕷的變種粉背薯蕷〔D.collettiivar.hypoglauca（Palibin）C.T. Ting et al.〕主要分布于安徽、福建、廣東北部、廣西東北部、河南南部、湖北、湖南、江西、臺灣北部及浙江，與原變種的主要區(qū)別為藥隔分叉程度和蒴果形狀不同。叉蕊薯蕷藥隔寬度約為花藥的1～2倍；粉背薯蕷蒴果兩端平截，藥隔寬度約為花藥的1/2，蒴果上端稍寬，基部狹圓形，頂部與基部同寬[1-2]。Burkill[3]曾根據(jù)藥隔分叉程度和蒴果形狀將叉蕊薯蕷和粉背薯蕷劃分為2個種；裴鑒等[4]則認(rèn)為兩者外部形態(tài)的差別不嚴(yán)格，故定為原變種與變種。

叉蕊薯蕷是根狀莖組中非常獨(dú)特的具有“3枚雄蕊發(fā)育、花藥藥隔分叉”特征的類群，一些學(xué)者依據(jù)采自中國各地的標(biāo)本發(fā)表了一些與叉蕊薯蕷相象但似乎又有不同的種類。有些學(xué)者認(rèn)為[5]，這些類群分布有交叉，且外部形態(tài)的差別不嚴(yán)格，并最終將其歸并為1原變種1變種，即原變種叉蕊薯蕷及變種粉背薯蕷。這一認(rèn)定的依據(jù)是：叉蕊薯蕷及粉背薯蕷的分布在四川交叉，且前者向西南、后者向東北直至臺灣分布。有的學(xué)者還認(rèn)為[5]，兩者染色體數(shù)有差異，叉蕊薯蕷染色體數(shù)為20，粉背薯蕷染色體數(shù)為40；但杭悅宇[6]根據(jù)對叉蕊薯蕷和粉背薯蕷連續(xù)分布區(qū)的采集及觀察，認(rèn)為二者在形態(tài)上存在著非常明顯的連續(xù)變化，且叉蕊薯蕷和粉背薯蕷的染色體數(shù)均有20和40?；?個 cpDNA序列的分子系統(tǒng)研究結(jié)果則顯示[7]，叉蕊薯蕷和粉背薯蕷間的親緣關(guān)系極為相近。因此，現(xiàn)有的植物形態(tài)學(xué)、植物細(xì)胞學(xué)、植物地理學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果均表明對二者的分類界定應(yīng)重新考慮。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，各種分子生物學(xué)技術(shù)和方法為種內(nèi)變異和親緣關(guān)系的研究提供了新的手段。RAPD（random am p lified po lymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）是目前被廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記之一，它能極其明顯地揭示親緣關(guān)系十分相近的個體之間的遺傳變異，因此適合于檢測種及種下水平的多樣性，包括野生植物天然居群遺傳結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源評估和栽培植物品種鑒定等[8]。

作者利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對叉蕊薯蕷及粉背薯蕷分布區(qū)內(nèi)11個居群的遺傳多樣性進(jìn)行檢測分析，旨在探討叉蕊薯蕷種內(nèi)DNA分子水平上的變異與遺傳多樣性，也為叉蕊薯蕷的分類研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

叉蕊薯蕷6個居群（包括5個野生居群和1個栽培居群）及粉背薯蕷5個居群的產(chǎn)地見表1。野外調(diào)查并采集標(biāo)本，選取生長狀況良好的植株，采集植株中部的健康嫩葉，去除主脈后用體積分?jǐn)?shù)70％乙醇擦去葉片表面灰塵，放入密封袋內(nèi)用硅膠干燥保存。憑證標(biāo)本存于江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所，經(jīng)杭悅宇研究員鑒定。

實(shí)驗(yàn)用主要儀器有 PE-9700型 PCR儀（Perkin Elm er公司生產(chǎn)）和WV-BP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；使用的10× buffer、dNTPs、Mg2+和TaqDNA聚合酶均購自上海博彩生物科技有限公司，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組總 DNA的提取 參照 Paterson等[9]的CTAB法提取基因組總DNA，并溶解在滅菌雙蒸水中，置于-20℃儲存、備用。

表1 供試叉蕊薯蕷及粉背薯蕷各居群的基本情況Table1 Basic sta tus of tested popu la tion s of D iosco rea co llettii Hook.f.and D.co llettii var.hypog lauca（Pa lib in）C.T.T ing eta l.

1.2.2 引物篩選 采用64個隨機(jī)引物對叉蕊薯蕷云南麗江居群和粉背薯蕷湖南衡山居群的基因組總DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且穩(wěn)定性強(qiáng)的引物進(jìn)行全部居群基因組總DNA的RAPD擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.3 RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及擴(kuò)增結(jié)果的檢測擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為20μL，包含2.0μL10× buffer、0.2 mmo l·L-1dNTPs、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.2μmo l·L-1引物、0.4 UTaqDNA聚合酶和20 ng模板DNA，以滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。

RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3m in；然后于95℃變性30 s、38℃退火40s、72℃延伸1m in，共35個循環(huán)反應(yīng)；最后于72℃保溫7m in。擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃條件下保存。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.8％瓊脂糖凝膠（含0.5μg·mL-11×EB）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳時間約1 h。電泳結(jié)束后用WV-BP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

按照清晰易辨、重復(fù)、穩(wěn)定的原則對擴(kuò)增譜帶進(jìn)行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，同一位置沒有條帶則記為“0”，據(jù)此形成 RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計每個引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)及其中的多態(tài)性條帶數(shù)，并計算多態(tài)性條帶百分率。

應(yīng)用 POPGENE1.31軟件計算有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、基因分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）、遺傳相似系數(shù)和遺傳距離；基于遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法對11個居群進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同引物 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果的比較分析

經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增，從64個隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且穩(wěn)定性強(qiáng)的14個寡聚核苷酸引物用于叉蕊薯蕷和粉背薯蕷11個居群基因組總DNA的RAPD-PCR擴(kuò)增，引物的序列及擴(kuò)增結(jié)果見表2。14個寡聚核苷酸引物共擴(kuò)增出170條帶，平均每個引物擴(kuò)增出12.1條帶，其中多態(tài)性條帶161條，平均每個引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)為11.5條，多態(tài)性條帶百分率達(dá)94.71％。其中，引物 a-17、au-04、b-2、b-4、b-5和 b-19擴(kuò)增出的條帶全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率均為100.00％。

2.2 叉蕊薯蕷和粉背薯蕷居群的 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳變異分析

由叉蕊薯蕷和粉背薯蕷各居群的 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果（表3）可見，5個粉背薯蕷居群的多態(tài)性條帶百分率變化幅度相對較大，為81.25％～89.29％，而6個叉蕊薯蕷居群的多態(tài)性條帶百分率變化幅度相對較小，為82.00％～84.21％。在參試的11個居群中，粉背薯蕷江西廬山居群擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多，達(dá)75條，多態(tài)性條帶百分率也最高，達(dá)89.29％；粉背薯蕷浙江臨安居群擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最少，僅39條，多態(tài)性條帶百分率也最低，僅81.25％。

盡管叉蕊薯蕷和粉背薯蕷的外部形態(tài)高度相似，但從不同居群多態(tài)性條帶百分率的變化幅度可以看出粉背薯蕷遺傳多樣性更豐富，間接顯示區(qū)域比形態(tài)更易造成二者的遺傳分化，同屬同組狹域分布的盾葉薯蕷（D.zingiberensisC.H.Wright）居群間的多態(tài)性條帶百分率較低也證明了這一點(diǎn)[10]。

表2 用于叉蕊薯蕷和粉背薯蕷基因組總DNA RAPD-PCR的隨機(jī)引物堿基序列及擴(kuò)增結(jié)果Table2 Base sequences of random pr im ers used for RAPD-PCR of genom ic tota lDNA of D iosco rea co llettii Hook.f.and D.co llettii var. hypog lauca（Pa lib in）C.T.T ing eta l.and itsam p lified resu lts

表3 叉蕊薯蕷和粉背薯蕷各居群基因組總DNA的 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果Table3 RAPD-PCR am p lified resu lts of genom ic tota l DNA of d ifferen t popu la tion s of D iosco rea co llettii Hook.f.and D.co llettii var.hypog lauca（Pa lib in）C.T.T ing eta l.

統(tǒng)計和計算結(jié)果表明，粉背薯蕷各居群間的有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）和Shannon多樣性指數(shù)（I）分別為1.3685、0.2384和0.3763；叉蕊薯蕷各居群間的Ne、h和I分別為1.3311、0.1972和0.2983。叉蕊薯蕷與粉背薯蕷的基因分化系數(shù)（Gst）為0.1228，即在總的變異中，有12.28％的變異存在于這一個類群間，87.72％的變異存在于各自的居群間，表明叉蕊薯蕷和粉背薯蕷作為原變種和變種的相對獨(dú)立性。同時，也有研究表明單子葉植物近緣種的基因分化系數(shù)平均值為0.231，表示有76.9％的變異存在于種內(nèi)居群間[11]。結(jié)合上述研究結(jié)果可見，叉蕊薯蕷和粉背薯蕷的遺傳變異符合“種內(nèi)遺傳變異大于種間遺傳變異”的普遍性規(guī)律。

叉蕊薯蕷和粉背薯蕷之間的基因流（Nm）為3.5707，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于盾葉薯蕷的Nm（0.9641）[10]及薯蕷科近緣植物延齡草（TrilliumtschonoskiiMaxim.）的Nm（0.4002）[12]，表明叉蕊薯蕷和粉背薯蕷之間存在非常多的基因交流。

2.3 叉蕊薯蕷和粉背薯蕷各居群的遺傳距離及聚類分析

參試的叉蕊薯蕷6個居群和粉背薯蕷5個居群間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)見表4。由表4可見，粉背薯蕷江西廬山居群和叉蕊薯蕷云南麗江居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，達(dá)0.6931；叉蕊薯蕷云南蒙自居群和云南景洪居群間的遺傳距離最近，僅0.2194。叉蕊薯蕷與粉背薯蕷間的遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.9223，但遺傳距離僅為0.0809。

基于叉蕊薯蕷和粉背薯蕷居群間的遺傳相似系數(shù)（表4），采用UPGMA聚類分析方法獲得的參試11個居群的聚類圖見圖1。由圖1可見，參試的6個叉蕊薯蕷居群和5個粉背薯蕷居群可分成4組，即所有的叉蕊薯蕷居群和粉背薯蕷浙江臨安居群聚為第1組，粉背薯蕷重慶南川居群和湖南衡山居群聚為第2組，粉背薯蕷湖南永順居群和江西廬山居群則各自單獨(dú)成組，且粉背薯蕷江西廬山居群與其他居群的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

聚類分析結(jié)果表明，叉蕊薯蕷及粉背薯蕷11個居群的分組情況是以類群為主要依據(jù)的，而在各類群內(nèi)部則基本以區(qū)域分布為分組依據(jù)，惟一例外的是粉背薯蕷浙江臨安居群與叉蕊薯蕷的6個居群同組，雖然和絕大多數(shù)叉蕊薯蕷居群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但卻較叉蕊薯蕷四川峨眉居群與絕大多數(shù)叉蕊薯蕷居群的親緣關(guān)系更近。

表4 叉蕊薯蕷和粉背薯蕷各居群間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離1）Table4 Genetic sim ilar ity coefficien t and genetic d istance am ong d ifferen t popu la tion s of D iosco rea co llettii Hook.f.and D.co llettii var. hypog lauca（Pa lib in）C.T.T ing eta l.1）

圖1 基于遺傳相似系數(shù)的叉蕊薯蕷和粉背薯蕷不同居群的 UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of d ifferen t popu la tion s of D iosco rea co llettii Hook.f.and D.co llettii var.hypog lauca（Pa lib in）C.T. T ing eta l.based on genetic sim ilar ity coefficien t

3 討 論

叉蕊薯蕷是 Hooker JD在1892年依據(jù)采自緬甸撣邦地區(qū)的標(biāo)本訂名發(fā)表的。此后，一些學(xué)者依據(jù)采自中國各地的標(biāo)本發(fā)表了一些主要特征與叉蕊薯蕷相似的新種，如D.hypoglaucaPalibin（福建葛嶺）、黑葉薯蕷D.nigrescensKnuth（云南思茅）、D.morseiPrain et Burkill（江西廬山牯嶺）、D.oeneaPrain et Burkill（四川城口）、D.kelungensisHayata（臺灣基?。?、D.tashiroiHayata（臺灣）和D.undulateKnuth（重慶南川）等[13]，但隨著研究的不斷深入，學(xué)者們認(rèn)為這些種可歸并為數(shù)種[14]、2種[5]、1種[15-16]或1正種及1變種[1]。裴鑒等[4]認(rèn)為，除黑葉薯蕷外，這些種類全部都在粉背薯蕷的分布區(qū)域內(nèi)，因而將它們都?xì)w并入叉蕊薯蕷或粉背薯蕷，并將叉蕊薯蕷定為原變種、粉背薯蕷定為變種。盡管叉蕊薯蕷分布區(qū)較窄，但是形態(tài)分化卻較大，如叉蕊薯蕷的云南麗江居群葉片大、草質(zhì)程度高；云南蒙自居群果實(shí)少、透明，全莖、花梗及果實(shí)均為鮮艷的紫紅色等等，這些都充分證明了其分布地為強(qiáng)烈分化的起源地。然而，不同分布區(qū)的粉背薯蕷形態(tài)基本一致，較少出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

鑒于薯蕷屬植物為雌雄異株，本研究結(jié)果又表明叉蕊薯蕷和粉背薯蕷具有很高的遺傳多樣性（多態(tài)性條帶百分率在81％以上）和基因流（3.5707），在一定程度上說明野生狀態(tài)下它們的繁殖過程主要通過有性繁殖的方式來完成。叉蕊薯蕷和粉背薯蕷所在的薯蕷屬根狀莖組植物的傳粉方式有蟲媒[17]和風(fēng)媒[18]等多種途徑，而且雌雄花完全開放且不具有零余子，表明無論采用何種傳粉方式，根狀莖組植物都通過有性繁殖途徑繁衍后代[18]。盡管薯蕷屬根狀莖組植物的根莖具有無性繁殖能力，但是在野外狀況下，1個根狀莖通常只生長出1支纏繞莖，沒有出現(xiàn)由于根狀莖逐年增生而在1個基株上生長出多個單株的情況[18-19]，這也證明了薯蕷屬根狀莖組植物在野生狀況下主要的繁殖方式為有性繁殖。

在聚類圖上，粉背薯蕷浙江臨安居群和叉蕊薯蕷聚合在一起；從形態(tài)上看，粉背薯蕷浙江臨安居群和粉背薯蕷其他居群有所差別，其花、莖和果實(shí)的顏色為綠色中帶有紫紅色，這一特征和叉蕊薯蕷云南蒙自居群相似。推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有2個：①作為原變種和變種的叉蕊薯蕷和粉背薯蕷可能還存在著變種水平上的分化不完全；②叉蕊薯蕷和粉背薯蕷本身即為形態(tài)連續(xù)變化的1個類群?；?cpDNA的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果表明，叉蕊薯蕷和粉背薯蕷的trnL-F、rbcL和matK序列堿基有10個以內(nèi)的差異，在系統(tǒng)發(fā)生樹上兩者合為一支，支持率為60％[7]，也證明了叉蕊薯蕷和粉背薯蕷存在著變種水平的分化不完全。但叉蕊薯蕷和粉背薯蕷在地下莖解剖特征[20]、淀粉粒形態(tài)[21]、葉脈序結(jié)構(gòu)以及葉表皮解剖特征[6]上又存在著明顯的差異，如：叉蕊薯蕷具導(dǎo)管而粉背薯蕷具管胞；叉蕊薯蕷地下莖淀粉粒偶有由2～3小粒淀粉粒組成的復(fù)粒且長度為14～22μm，而粉背薯蕷地下莖淀粉粒無復(fù)粒且長度為25～47μm；叉蕊薯蕷葉脈的末次脈邊緣結(jié)環(huán)狀而粉背薯蕷不結(jié)環(huán)；粉背薯蕷葉表皮存在二叉表皮毛而叉蕊薯蕷沒有，這些不同的特征均表明粉背薯蕷有異于叉蕊薯蕷。綜合以上結(jié)果認(rèn)為，叉蕊薯蕷和粉背薯蕷為原變種和變種的關(guān)系，兩者間還存在著變種水平上的分化不完全。

[1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第十六卷第一分冊[M].北京：科學(xué)出版社，1985：54-120.

[2］D ing Z Z，GilbertMG.Flora of China：Vo l.24[M].Beijing： Science Press，2000：276-296.

[3］Burkill FLSI H.The o rganography and the evo lution of D iosco reaceae，the fam ily of the Yam s[J].Journal of the L innean Society of London：Botany，1960，56：319-412.

[4］裴 鑒，丁志遵，秦慧貞，等.中國薯蕷屬根莖組系統(tǒng)分類的初步研究[J].植物分類學(xué)報，1979，17（3）：61-72.

[5］江蘇省植物研究所薯蕷課題研究組.中國薯蕷屬根狀莖組植物的分類和染色體數(shù)的研究[J].植物分類學(xué)報，1976，14（1）：65-72.

[6］杭悅宇.中藥萆薢的原植物、鑒定及質(zhì)量評價研究[D].南京：中國藥科大學(xué)生藥學(xué)院，2007：48-55.

[7］Gao X，Zhu Y P，Wu BC，et al.Phylogeny ofDioscoreaSect.Stenophorabased on chlorop lastmatK，rbcLandtrnL-Fsequences [J].Journal of Systematics and Evolution，2008，46（3）：315-321.

[8］鄒喻蘋，葛 頌，王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[9］Paterson A H，Brubaker C L，Wendel J F.A rap id method for extraction of cotton（Gossypiumspp.）genom ic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J].Plant Molecular Biology Reporter，1993，11（2）：122-127.

[10］黃春洪，杭悅宇，周義鋒，等.我國盾葉薯蕷居群遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].云南植物研究，2003，25（6）：641-647.

[11］Ham rick JL.Isozymesand the analysis of genetic structure in p lant populations[M]∥Soltis DE，So ltis P S.Isozymes in Plant Bio logy.London：Chapman and Hall，1990：87-105.

[12］李 群，肖 猛，郭 亮，等.四川省珍稀瀕危植物延齡草遺傳多樣性分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27（4）：1-6.

[13］萬金榮，丁志遵，周太炎.叉蕊薯蕷類群分類學(xué)的初步研究[M]∥南京中山植物園研究論文集編輯組.南京中山植物園研究論文集：1990.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1991：41-45.

[14］Knuth R.D ioscoreaceae[M]∥Engler A.Das Pflanzenreich.Leipzig：Verlag vonWilhelm Engelmann，1924：252-254，315.

[15］中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志：第三卷[M].北京：科學(xué)出版社，1983：717-719.

[16］中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南種子植物名錄：下冊[M].云南：云南人民出版社，1984：1981-1982.

[17］趙亞美，杭悅宇，周義峰，等.柴黃姜的傳粉生物學(xué)特性[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2008，17（2）：15-21.

[18］趙亞美.薯蕷屬（DioscoreaL.）植物傳粉生物學(xué)研究[D].南京：江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所，2008：29-34.

[19］王筱璐，吳寶成，周義峰，等.野生及栽培盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）的性別特征觀察 [J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2010，19（2）：15-20.

[20］杭悅宇，秦慧貞，徐珞珊，等.薯蕷屬根狀莖的組織結(jié)構(gòu)和萆薢類鑒別[J].西北植物學(xué)報，2006，26（12）：2423-2429.

[21］杭悅宇，徐珞珊，史德榮，等.中國薯蕷屬植物地下莖淀粉粒形態(tài)特征及其分類學(xué)意義[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2006，15（4）：1-8.