徐敬明

（重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 重慶 402168）

兩種近方蟹線粒體16S rRNA基因序列分析

徐敬明

（重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 重慶 402168）

測(cè)定了絨螯近方蟹和肉球近方蟹線粒體16S rRNA基因部分片段的序列，其長(zhǎng)度分別為529bp和525bp。二者的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似，分別為36.3%、37.2%、15.9%、10.6%，35.2%、 37.5%、 17.1%、10.2%；不包括4處插入/缺失位點(diǎn)，兩序列間有31個(gè)變異位點(diǎn)，核苷酸差異率為5.91%，其中轉(zhuǎn)換18個(gè)、顛換13個(gè), 轉(zhuǎn)換與顛換比約為1.4。對(duì)國(guó)外3種近方蟹的16S rRNA基因序列與本文的2種近方蟹序列一起比對(duì)獲得512bp的同源序列（含插入/缺失位點(diǎn)）進(jìn)行分析，A+T的平均含量為73.5%，明顯高于G＋C的平均含量，共檢測(cè)到變異位點(diǎn)67個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)19個(gè)。基于已知的弓蟹科43種蟹類(lèi)的16S rRNA基因502bp同源序列獲得的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus屬的蟹類(lèi)各自聚為一支，且與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致，表明其分別為一單系；但Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus屬的蟹類(lèi)卻沒(méi)有各自聚為一支，分子數(shù)據(jù)不支持它們分別為一單系。

絨螯近方蟹；肉球近方蟹；16S rRNA；序列；系統(tǒng)發(fā)生

近方蟹（Hemigrapsus）隸屬甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、弓蟹亞科（Varuninae），其中絨螯近方蟹（H. penicillatus）和肉球近方蟹（H. sanguineus）不僅外形相似，而且生活環(huán)境也基本相同，均棲息于海邊巖石下或石縫中；數(shù)量較大，是制作蟹穌、蟹醬的原料，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。近來(lái)，一些學(xué)者根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)的研究將方蟹科提升為方蟹總科（Grapsoidea），弓蟹亞科提升為弓蟹科（Varunidae）[2,3]。動(dòng)物線粒體 DNA（mtDNA）因其分子量小、母系遺傳、比核DNA進(jìn)化速率快等特征而廣泛的應(yīng)用于進(jìn)化生物學(xué)研究中；而mtDNA 16S rRNA基因有較高的保守性，易于進(jìn)行PCR引物的設(shè)計(jì)和擴(kuò)增，非常適合于種及其以上分類(lèi)階元的差異研究[4,5]。16S rRNA基因序列已被廣泛用于蟹類(lèi)的分子系統(tǒng)學(xué)研究[6-12]，已有一些學(xué)者對(duì)部分近方蟹16S rRNA基因序列進(jìn)行了分析[13-17]。

本研究采用線粒體16S rRNA基因作為分子標(biāo)記，對(duì)產(chǎn)于中國(guó)的兩種近方蟹進(jìn)行了序列測(cè)定和分析；結(jié)合從GenBank下載的有關(guān)近方蟹等蟹類(lèi)的基因序列，進(jìn)行分子系統(tǒng)關(guān)系分析，探討它們之間的遺傳差異及親緣關(guān)系，以期為蟹類(lèi)的種質(zhì)鑒定、物種保護(hù)和資源評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料，為進(jìn)一步研究蟹類(lèi)分子系統(tǒng)學(xué)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用絨螯近方蟹和肉球近方蟹于 2006年 9月采自山東省青島沿海潮間帶巖石灘，保存于 -40℃ 冰箱中備用。每種取3個(gè)個(gè)體用于序列分析。

1.2 DNA提取

從絨螯近方蟹和肉球近方蟹的步足和螯足中取約50 mg肌肉，采用傳統(tǒng)法（酚/氯仿抽提法）從肌肉組織中提取基因組DNA。將乙醇沉淀后DNA溶解入40 μL超純水，放入4 ℃冰箱6 h，最后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

以 L2510 5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’和 H3059 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3’為引物對(duì)16S rRNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體積為 25 μL，反應(yīng)液中含 2.5 μL 10×PCR buffer， 2.0 μL dNTPs （2.5mmol/L），2.0μL MgCl2（25 mmol/L），1μL 模板 DNA，引物各0.5 μL（10 μmol/L），0.2 μL Taq 酶（5 U/μL），無(wú)菌去離子水補(bǔ)足到25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性1.5 min后，94 ℃變性30 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)39次，然后在72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

1.4 序列測(cè)定

PCR產(chǎn)物用含有溴化乙錠的 1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。對(duì)于擴(kuò)增效果良好的樣品進(jìn)行回收，回收時(shí)用1.0 % 瓊脂糖凝膠，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit（寶生物工程（大連）有限公司）進(jìn)行回收和純化，純化產(chǎn)物送至上海英駿測(cè)序公司，用 ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行正反鏈雙向測(cè)序。測(cè)序所用引物和PCR擴(kuò)增時(shí)的引物相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)仔細(xì)核對(duì)測(cè)序膠圖后的正反向序列，均由DNASTAR 軟件包（DNASTAR，Inc.，Madison，USA）進(jìn)行編輯、校對(duì)和比對(duì)，并對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行分析；所有序列為兩端去引物后的序列。用DNASP軟件檢測(cè)變異位點(diǎn)數(shù)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)。用MEGA（Version4.0）軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成，計(jì)算種間的遺傳距離，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和分子進(jìn)化分析。

2 結(jié) 果

不包括引物，絨螯近方蟹和肉球近方蟹的16S rRNA基因片段長(zhǎng)度分別為 529bp和 525bp（GenBank登錄號(hào)分別為：GU731424和GU731425）；每種的3個(gè)個(gè)體之間沒(méi)有序列差異。二者核苷酸序列A、T、G、C的含量相似，分別為36.3 %，37.2 %，15.9 %，10.6 %，35.2 %，37.5 %，17.1 %，10.2 %；不包括4處插入/缺失位點(diǎn)，兩序列間有31個(gè)變異位點(diǎn)，核苷酸差異率為5.91%，其中轉(zhuǎn)換18個(gè)、顛換13個(gè)（圖1）, 轉(zhuǎn)換與顛換比約為1.4。

從GenBank下載其它三種近方蟹的16S rRNA基因序列（種名及 GenBank序列號(hào)見(jiàn)圖 2），與本文的兩種近方蟹序列一起比對(duì)獲得512bp的同源序列（含插入/缺失位點(diǎn)），除插入/缺失位點(diǎn)外共檢測(cè)到變異位點(diǎn)67個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)19個(gè)，A，T，G，C的含量只有略微的差異，平均含量分別為36.6 %，36.9 %，16.3 %，10.2 %，堿基 C的含量最少，A＋T含量（73.5%）明顯高于G＋C含量。此種類(lèi)型的堿基含量與其它蟹類(lèi)的16S rRNA基因是一致的[2,12,19]。參照Ng2008的蟹類(lèi)分類(lèi)系統(tǒng)[3]，將已知的弓蟹科43種蟹類(lèi)的16S rRNA基因序列（種名及GenBank序列號(hào)見(jiàn)圖2）進(jìn)行比對(duì)獲得502 bp同源序列（含插入/缺失位點(diǎn)），除插入/缺失位點(diǎn)外共檢測(cè)到變異位點(diǎn)153個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)120個(gè)，A，T，G，C的含量差異較小，平均含量分別為 36.1%，36.9%，16.8%，10.2%，同樣表現(xiàn)出堿基C的含量最少，A＋T含量（73%）明顯高于G＋C含量的特點(diǎn)。所有序列之間基于 Kimura-雙參數(shù)距離模型估計(jì)其遺傳距離；用 NJ法（Neighbor-Joining）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖2），系統(tǒng)樹(shù)各結(jié)點(diǎn)的支持率以序列數(shù)據(jù)集 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值（Bootstrap value）表示，各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50 %的支持率。

圖 1 絨螯近方蟹和肉球近方蟹16S rRNA基因片段序列比對(duì)Fig. 1 Sequences alignment of the 16S rRNA segment of H. penicillatus and H. sanguineus

由系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖2）看出，現(xiàn)有已知 16S rRNA基因分子數(shù)據(jù)的弓蟹科蟹類(lèi)中，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus屬的蟹類(lèi)各自聚為一支；而Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus屬的蟹類(lèi)卻沒(méi)有各自聚為一支。

3 討 論

兩種近方蟹16S rRNA基因5.91%的種間差異明顯低于紅螯相手蟹和褶痕相手蟹的16S rRNA基因的差異（8.07%）[19]，以及寬身大眼蟹和日本大眼蟹的16S rRNA基因的差異（12.26 %）[12]；表明兩種近方蟹的親緣關(guān)系相對(duì)較近，這與二者外形相似甚至其雌性和幼體不易區(qū)分等形態(tài)特征相符合，因此，16S rRNA基因分子數(shù)據(jù)支持二者在形態(tài)分類(lèi)上隸屬于近方蟹屬（Hemigrapsus）。

迄今為止共有日本、克羅地亞、臺(tái)灣和中國(guó)連云港4個(gè)地方的肉球近方蟹的16S rRNA基因序列報(bào)道過(guò)（GenBank號(hào)分別為：AB058630、AJ493053、AJ493054、EU367395），上述序列與本研究的 16S rRNA基因序列比對(duì)獲得了386bp同源序列（無(wú)插入缺失），結(jié)果是與臺(tái)灣的序列僅有 2bp的差異，核苷酸差異率僅為0.52 %，遠(yuǎn)小于Schubart的1.5 %的種間差異標(biāo)準(zhǔn)[20]，二者屬于肉球近方蟹的不同地理種群的單倍型，而與其它三地的序列則完全相同。

絨螯近方蟹的16S rRNA基因序列與報(bào)道過(guò)的日本、法國(guó)的序列比對(duì)（GenBank號(hào)分別為：AB058628、AJ278835），在獲得的480bp的同源序列中（無(wú)插入缺失），青島的序列與日本和法國(guó)的序列之間分別僅有1bp和4bp的差異，而日本與法國(guó)的序列之間的差異也僅為 3bp，它們之間的核苷酸差異率最大僅為0.83 %，也是遠(yuǎn)小于1.5 %，三者分屬于絨螯近方蟹的不同地理種群的單倍型。

這表明各地的絨螯近方蟹和肉球近方蟹的分化時(shí)間較短，遺傳分化較??；同時(shí)也進(jìn)一步表明原本無(wú)絨螯近方蟹和肉球近方蟹分布的歐洲，是由于人為原因?qū)⒃瓋H分布于東亞的兩種近方蟹傳播至歐洲的[16]。

43種弓蟹科蟹類(lèi)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖 2）表明，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus屬的蟹類(lèi)各自聚為一支，與其形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致，分子數(shù)據(jù)支持其分別為一單系；但Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus屬的蟹類(lèi)卻沒(méi)有各自聚為一支，分子數(shù)據(jù)不支持它們分別為一單系，表現(xiàn)出與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果的不一致[3]，因此，它們之間的系統(tǒng)關(guān)系還有待于對(duì)其更多基因和形態(tài)進(jìn)行更深入研究后得以進(jìn)一步確定。

圖2 弓蟹科蟹類(lèi)的16S rRNA基因分子系統(tǒng)樹(shù)(NJ法)Fig. 2 Neighbor-Joining molecular phylogenetic tree of 16S rRNA gene for Varunid crabs

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Sequence analyses of mitochondrial 16S rRNA gene between two species ofHemigrapsus

XU Jing-ming

（College of Life Science and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402168, China）

Partial sequences of the mitochondrial 16S rRNA gene were determined forHemigrapsus penicillatusandH. sanguineus, and the sequence lengths of them were 529bp and 525bp respectively. The A, T, G and C contents were similar, which were 36.3%, 37.2%, 15.9%, 10.6% and 35.2%, 37.5%, 17.1%, 10.2% respectively. There were 31 different sites (excluding 4 deletion/insertion sites) between two species, including 18 transition sites and 13 transversion sites. The si/sv and ratio of sequence divergence were about 1.4 and 5.91% respectively. Furthermore,512bp homologous segments of fiveHemigrapsusspecies were analyzed. The results showed that the average A+T content (73.5%) was higher than G+C content, and there were 67 variable sites and 19 parsimony-information sites in the nucleotides of the data. Topological structure of the molecular phylogenetic tree constructed by 502bp homologous segments of 16S rRNA gene from 43 species of Varunid crabs with Neighbor-Joining method showed that the species ofHelicana,Eriocheir,Helice,Cyrtograpsus,MetaplaxandBrachynotusspecies were clustered into distinct clades respectively, which indicated the monophyly of the genera respectively. But, the species ofHemigrapsus,GaeticeandCyclograpsuswere not clustered into distinct clades respectively, which revealed that the genera might not be monophyletic respectively.

Hemigrapsus penicillatus；H. sanguineus；16S rRNA；Sequence；Phylogeny

Q178.53;Q953

A

1001-6932(2010)06-0638-05

2010-02-19；收修改稿日期：2010-5-10

重慶文理學(xué)院引進(jìn)人才專(zhuān)項(xiàng)（No.200803）

徐敬明（1963—），男，教授，博士，主要從事動(dòng)物分子與生理生態(tài)研究，電子信箱：xjingming@163.com。