趙鴻霞 周大勇 秦 磊 朱蓓薇 王曉慧

（大連工業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

響應(yīng)面法優(yōu)化海參卵酶解工藝

趙鴻霞 周大勇 秦 磊 朱蓓薇 王曉慧

（大連工業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

以水解度和肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從4種酶中選擇出木瓜蛋白酶為水解海參卵最佳用酶。利用二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)，建立關(guān)于木瓜蛋白酶水解海參卵過程中溫度、pH值、底物濃度對(duì)水解度影響的三元二次方程。通過對(duì)方程的擬合分析得到木瓜蛋白酶的最佳工藝條件并修正為：溫度52℃、pH值5.5、底物濃度8.4%、加酶量2 500U/g、反應(yīng)時(shí)間4h。在此條件下，水解度為20.51%。

海參卵；酶解；響應(yīng)面

生物活性肽是蛋白質(zhì)中20個(gè)天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的肽類的總稱［1］。研究［2］表明，活性肽具有調(diào)節(jié)免疫力、調(diào)節(jié)激素分泌、抗腫瘤、降血壓、抗氧化、抗疲勞、改善元素吸收及運(yùn)輸和促進(jìn)生長(zhǎng)等作用，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于生物中天然存在的活性肽含量較低，不適合大規(guī)模開發(fā)利用，近年來研究者多以生物蛋白為原料降解制備活性肽［3］。目前，大量的生物活性肽被發(fā)現(xiàn)并已廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品及化妝品等領(lǐng)域，取得了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益［4］。

海參卵 （刺參，stichopus japonicus），俗稱海參花，是海參加工過程中產(chǎn)生的廢棄物之一。海參卵不僅與海參體壁含有同樣豐富的蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)，而且許多珍貴營(yíng)養(yǎng)成分含量更高，如多糖、釩、核酸、性腺色素、精氨酸等。海參腸卵中釩的含量是海參體壁的3～4倍。釩能維持機(jī)體正常的糖代謝作用，有效地防治糖尿病，還能刺激機(jī)體的造血功能，促進(jìn)骨骼的造血能力［5］。近年來，中國(guó)海參產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2008年，中國(guó)海參總產(chǎn)量約為9萬t［6］。本試驗(yàn)以海參卵為原料，利用生物酶法制備生物活性肽，并通過響應(yīng)面法對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，可為海參卵的加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

海參卵：大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)有限公司；

堿性蛋白酶（Alc）：49 600U/g，四川華威高科技生物有限公司；

中性蛋白酶（Neu）：59 000U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶（Try）：52 900U/g，夏門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；

木瓜蛋白酶（Pap）：44 700U/g，上海生物工程有限公司；

其他試劑與藥品：均為市售分析純。

1.2 主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

精密電子天平：JJ200Y型，美國(guó)雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司；

集中式恒溫加熱磁力攪拌器：DF－101S，鞏義市英峪予華儀器廠；

超濾攪拌器：8050，Millipore（密理博）公司；

真空冷凍干燥機(jī)：2KBTES－55，美國(guó)VirTis公司；

組織搗碎勻漿機(jī)：JJ－2型，金壇市富華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理 海參卵經(jīng)清洗、冷凍干燥、粉碎、過100目篩后，貯于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原料的酶解 分別采用木瓜蛋白酶（Pap）、中性蛋白酶（Neu）、胰蛋白酶（Try）和堿性蛋白酶（Alc）對(duì)海參卵酶解，根據(jù)文獻(xiàn)［7－8］并結(jié)合酶制劑說明書制定各種酶的酶解條件見表1，操作過程如下：

精密稱取原料→加水→調(diào)pH值→加酶→保溫水解→滅酶（100℃，10min）→定容→離心（4 000r/min，10min）→上清液（測(cè)水解度）超濾→冷凍干燥

表1 4種酶的試驗(yàn)條件Table 1 Hydrolytic conditions for the four enzymes used

1.3.3 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法［9－11］。水解度（DH）按式（1）計(jì)算：

1.3.4 其它測(cè)定方法

（1）總氮含量：采用微量凱氏定氮法［12］；

（2）酶活力測(cè)定：采用Folin－酚法［13］。

1.3.5 單因素試驗(yàn) 以木瓜蛋白酶為水解酶，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究酶加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度和底物濃度等對(duì)酶解效果的影響?；緱l件為：酶加量2 500U/g；底物濃度8%；pH 6.5；反應(yīng)溫度55℃；水解時(shí)間3h，改變其中一個(gè)條件，固定其它條件以分別考察不同的影響因素，各因素水平梯度分別為：反應(yīng)溫度45，50，55，60，65 ℃；pH 4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5；酶加量1 500，2 000，2 500，3 000，3 500，4 000U/g；底物濃度4%，6%，8%，10%，12%；去離子水體系水解時(shí)間0.5，1.5，2.0，3.0，4.5，5.0h；緩沖液體系水解時(shí)間1.5，2.5，3.5，4.5，5.0h。水解完成后在沸水浴中保持10min滅酶，采用甲醛滴定法測(cè)定水解度。1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用Design－Expert軟件根據(jù)Box中心組合原理［14］，以海參卵水解度DH（%）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定一個(gè)最佳的酶解條件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design－Expert 7.0軟件進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，通過回歸擬合后期望得到主要試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/p>

式中：

Y——預(yù)測(cè)響應(yīng)值即水解度DH，%；

β0，βi，βii，βij—— 分別是偏移項(xiàng)、線性偏移、二階偏移系數(shù)和交互效應(yīng)系數(shù)；

Xi—— 各因素水平值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶酶解效果的比較

由表2可知，水解產(chǎn)物的水解度高，肽得率也相應(yīng)較高。但這種規(guī)律并不嚴(yán)格，肽得率的除了受水解度影響，還與酶的特異性有關(guān)［15］。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的效益，選擇肽得率較高的木瓜蛋白酶為水解用酶。

表2 4種酶酶解產(chǎn)物的水解度和肽得率Table 2 DH and yield of peptide of the hydrolysates derived from the four enzymes

2.2 響應(yīng)面法對(duì)酶解工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，并依據(jù)提高效率、節(jié)約成本的原則，將加酶量定為2 500U/g，酶解時(shí)間定為4.0h。利用Design－Expert軟件根據(jù)Box中心組合原理設(shè)計(jì)了因素水平表（見表3）共16個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中1～12為析因試驗(yàn)，13～16為中心點(diǎn)試驗(yàn)用來估算誤差，以此確定利用木瓜蛋白酶酶解海參卵功能肽的最佳工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 3 Factors and levels in response surface design

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)表4試驗(yàn)結(jié)果，采用Design－Expert 7.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定，概率（P＞F）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高（P＞F小于0.05是顯著的）。由響應(yīng)面結(jié)果的方差分析可知，模型P＞F值（＜0.000 1）意味著此二次模型是極顯著的，即模型建立成功；且溫度項(xiàng)A、底物濃度項(xiàng)C、交互項(xiàng)BC、平方項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響顯著；pH值項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、AC對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響不顯著。

表4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Box－Behnken

表5 響應(yīng)面二次模型的方差分析ńTable 5 Analysis of variance of quadratic model in RSM

用Design－Expert 7.0軟件分析模型的可信度，見表6，得出回歸方程的各因變量和全體自變量之間的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝107.35/108.96＝0.985 2，說明響應(yīng)值（水解度）的變化有98.52% 來源于所選變量，即提取溫度、pH和底物濃度，因此回歸方程能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件；一般來說，信噪比大于4時(shí)模型可信，試驗(yàn)測(cè)得信噪比為18.093，遠(yuǎn)大于4，進(jìn)一步說明模型可靠。

表6 模型的可信度分析Table 6 The credibility analysis of the model

根據(jù)Design－Expert 7.0軟件得出回歸模型各因素相互作用的效應(yīng)圖，見圖1～3。

圖1 溫度與pH值關(guān)于水解度的等高線和響應(yīng)面圖Figure 1 RSM contour plots showing effect of Temp and pH on DH

圖3 pH值與底物濃度關(guān)于水解度的等高線和響應(yīng)面圖Figure 3 RSM contour plots showing effect of pH and substrate concentration on DH

圖1顯示pH值與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)水解度的影響，固定了底物濃度為8%，形成了pH值與反應(yīng)溫度的等高線及響應(yīng)面圖，從圖中可以看出，因素A、B對(duì)Y是非線性的，因?yàn)楸砻鎴D發(fā)生彎曲，可以做進(jìn)一步優(yōu)化分析。同理從圖2、圖3也可以看到表面圖發(fā)生彎曲，得出A、C，B、C對(duì)Y也存在二次項(xiàng)，可以做進(jìn)一步優(yōu)化分析。

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design－Expert7.0軟件各因素進(jìn)行回歸擬合分析得到的海參卵水解度（用Y表示）的回歸方程：

Y＝－52.80＋1.42A＋9.50B＋2.39C－3.89×10－3AB＋2.67×10－3AC＋0.65BC－0.014A2－1.34B2－0.36C22.2.2 響應(yīng)因子的水平優(yōu)化 各因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design Expert 7.0軟件，對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范形分析，尋求最大值的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平。根據(jù)三元二次回歸方程求最佳穩(wěn)定點(diǎn)（極值點(diǎn)）的值，分別對(duì)回歸方程各因素求一階偏導(dǎo)且令方程等于零，整理得：

解方程組得到模型的極值點(diǎn)為：A＝52.06，B＝5.50，C＝8.42。

把極值點(diǎn)代入回歸方程，解得方程最大值為20.27%。

即最佳理論工藝條件為：溫度52.06℃、pH值5.5、底物濃度8.41%、加酶量2 500U/g、反應(yīng)時(shí)間4h。在此條件下，理論水解度為20.27%。考慮到實(shí)際操作的便利，將酶解的最佳提取工藝條件修正為：溫度52℃、pH值5.5、底物濃度8.4%、加酶量2 500U/g、反應(yīng)時(shí)間4h。在此修正條件下，實(shí)際測(cè)得海參卵的水解度為20.51%，與此條件下的預(yù)測(cè)值相差不到0.5%，說明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，建立的回歸方程能真實(shí)地反映pH值、溫度、底物濃度對(duì)海參卵水解度的影響，通過此模型優(yōu)化能夠有效的提高海參卵的水解度。

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Optimization of the enzymatic hydrolysis of sea cucumber（stichopus japonicus）ovum with response surface method

ZHAOHong－xia ZHOU Da－yong QIN Lei ZHU Bei－weiWANG Xiao－h(huán)ui

（College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China）

In the present study，papain was selected as the optimum enzyme for hydrolysis of sea cucumber（stichopus japonicus）ovum from the four proteases as which lead to the highest degree of hydrolysis（DH）and yield of peptides.A ternary quadratic equation was established between temperature，pH，substrate concentration and DH based on quadratic rotation－orthogonal combination design.Through simulation analysis of the equation，the optimum conditions were obtained and listed below：the hydrolytic temperature is 52℃；the reactive pH is 5.5；the substrate concentration is 8.4%；the enzyme/substrate ratio is 2 500U/g；the hydrolytic time is 4h.Under such a condition，the hydrolysis degree is 20.51%.

sea cucumber ovum；enzymolysis；response surface method（RSM）

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.033

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2008BAD94B07）；遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：2008403003）

趙鴻霞（1977－），女，大連工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：398010423＠qq.com

周大勇

2010－06－01