洪亮,解修超,陳紹興,張永麗,陶宏征,楊建＊

(1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 蒙自 661100;2.陜西理工學(xué)院陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中 723000;3.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園,云南 勐臘 666303)

云南蘿芙木內(nèi)生放線菌分離研究

洪亮1,解修超2,陳紹興1,張永麗3,陶宏征1,楊建1＊

(1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 蒙自 661100;2.陜西理工學(xué)院陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中 723000;3.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園,云南 勐臘 666303)

對藥用植物云南蘿芙木進行內(nèi)生放線菌的分離.使用酒精和次氯酸鈉對樣品的根、莖、葉和果實進行表面消毒.采用兩種分離培養(yǎng)基和三種分離方法并且分別添加重鉻酸鉀進行分離.共分離到17株內(nèi)生放線菌.

云南蘿芙木;內(nèi)生放線菌;分離

云南蘿芙木(Ranvolfia Yunnanensis Tsiang)喜高溫濕潤氣候,能耐短期霜凍,在我省海拔900～1300m山地灌叢或山坡密林、溪邊潮濕肥沃的地方廣有分布,尤以西雙版納、思茅等地區(qū)多見,是我省珍貴的藥用植物之一.其根含利血平、阿馬里斯、蘿芙木堿等多種生物堿,其味苦、性寒、有微毒,具有降血壓、瀉肝火、鎮(zhèn)靜、解瘀等功效.自1952年Muller等人從蘿芙木植物中提取出利血平并發(fā)現(xiàn)它具有降壓和安定作用,且有較高的療效后,引起醫(yī)學(xué)界和藥學(xué)界的高度重視.蘿芙木是生產(chǎn)利血平和降壓靈的植物原料,國外以印度開發(fā)利用比較成功,其他國家和地區(qū)雖有生產(chǎn),但規(guī)模比較小.長期以來,各國都是利用野生資源生產(chǎn)利血平,資源已逐年減少,遠不能滿足生產(chǎn)的需求[1].

植物與微生物之間存在著一種復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系,在這個微生態(tài)中發(fā)揮重要作用的成員之一是植物內(nèi)生菌.研究表明,內(nèi)生菌具有多種生物學(xué)功能.另外一些研究表明藥用植物中一些內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生理活性成分以及其它特殊的生理活性物質(zhì),為解決藥用植物的資源危機提供了新的思路,己經(jīng)成為新的抗菌抗癌、抗植物病蟲害物質(zhì)的資源寶庫[2].

本研究以云南藥用植物蘿芙木為材料,通過不同的樣品預(yù)處理方法及不同的分離培養(yǎng)基對蘿芙木不同部位進行內(nèi)生放線菌的分離,以獲得適合其分離的方法,為研究和應(yīng)用藥用植物內(nèi)生放線菌奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品藥用植物云南蘿芙木

1.1.2 培養(yǎng)基S M2培養(yǎng)基,OA培養(yǎng)基,ISP2培養(yǎng)基

1.1.3 抑制劑分離培養(yǎng)基中加入抑制劑:重鉻酸鉀50mg/L,以抑制內(nèi)生真菌與細菌的生長.

1.2 方法

1.2.1 表面消毒

取蘿芙木的根、莖、葉、果,按下列程序進行表面消毒:自來水沖洗,75%酒精處理5min,無菌水沖洗3-4次,有效氯含量為5%的次氯酸鈉處理3-8 min(根、莖、葉、果處理時間不同),無菌水沖洗5次[3].

1.2.2 內(nèi)生放線菌的分離

在無菌的條件下,將已完成表面消毒的樣品放入研缽中,先取一部分用無菌小刀切成邊長為5mm左右的正方形小塊放入兩種分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)(直接貼片法),剩余的樣品加無菌水在研缽中研磨,取100ul研磨后的勻漿與未凝固的分離培養(yǎng)基進行混勻培養(yǎng)(混勻法),再取100ul勻漿于分離培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)(涂布法).培養(yǎng)溫度為28℃,培養(yǎng)時間為1-3周,以待放線菌的長出[4].

1.2.3表面消毒可靠性的檢驗

為了檢查表面消毒是否徹底,進行了對照實驗.將上述消毒處理最后一遍清洗的無菌水直接置于分離平板上,于相同的條件下培養(yǎng),以平板是否有菌生長,證實分離菌是否為內(nèi)生放線菌[3].

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒的可靠性

在用最后一次處理植物樣品的無菌水涂布的平板上,看不到有放線菌菌落的長出,偶爾只有零星的芽孢桿菌長出,而在對照的平板上,放線菌的生長占據(jù)優(yōu)勢.由此可以看出,一般放線菌在經(jīng)過我們的表面消毒程序后不能存活;盡管芽孢桿菌表現(xiàn)出一定的耐受性,但是它對內(nèi)生放線菌的分離不造成影響.

2.2 不同培養(yǎng)基內(nèi)生放線菌分離情況

采用兩種不同分離培養(yǎng)基對蘿芙木進行植物內(nèi)生放線菌分離,分離結(jié)果見圖1.

圖1 不同培養(yǎng)基分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)目

由圖1結(jié)果表明,使用兩種不同分離培養(yǎng)基,共分離得到17株內(nèi)生放線菌,并且全部由S M2培養(yǎng)基分離得到,分離效果明顯好于OA培養(yǎng)基.

2.3 不同樣品處理方法內(nèi)生放線菌分離情況

采用三種不同樣品處理方法對蘿芙木進行植物內(nèi)生放線菌分離,分離結(jié)果見圖2.

圖2 不同樣品處理方法分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)目

由圖2結(jié)果表明,混勻法分離到的內(nèi)生放線菌明顯多于涂布法和直接貼片法,可能是因為采用涂布法和貼片法的時候內(nèi)生菌未能從植物組織內(nèi)釋放出來,而混勻法能使植物組織內(nèi)生菌較好釋放出來.

2.4 蘿芙木不同部位內(nèi)生放線菌分離情況

對蘿芙木不同部位進行內(nèi)生放線菌分離,分離結(jié)果見圖3.

圖3 蘿芙木不同部位分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)目

由圖3結(jié)果表明,從蘿芙木不同部位分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)目是果實最多,其次是根部,最后是葉和莖.這與以往的研究基本相符,只是在果實中分離到較多的內(nèi)生放線菌,具有一定的開發(fā)利用潛力.

3 討論

從植物中分離放線菌,表面消毒是一個關(guān)鍵的步驟.植物的表面通常附著有比較多的真菌,培養(yǎng)時可能快速布滿整個平板,不利于放線菌的分離[5].酒精和次氯酸鈉作為表面消毒劑已經(jīng)廣泛用于分離植物內(nèi)生菌[6].實驗表明,我們采用的消毒方法能有效去除表面雜菌的污染,從植物中分離出內(nèi)生放線菌.

通常認為,植物體內(nèi)的內(nèi)生放線菌會因為植物種類、地域分布的不同而不同;也就是說,植物種類和分布的多樣性決定了植物內(nèi)生放線菌的多樣性[7].我國有著豐富的植物多樣性,尤其是民族藥用植物,以及廣闊的地域分布,因而在我國開展植物內(nèi)生放線菌的研究有著巨大的潛力.

[1]杜應(yīng)甲.漫談云南蘿芙木的開發(fā)利用[J].云南林業(yè),2007,28(1):21.

[2]洪亮.不同生境中稀有放線菌的研究進展[J].紅河學(xué)院學(xué)報,2009,7(2):27-30.

[3]陳華紅,徐麗華等.植物內(nèi)生放線菌的分離方法[J].微生物學(xué)通報,2006,33(4):182-185.

[4]洪亮.紅樹林環(huán)境稀有放線菌的分離、初步鑒定及活性評價[D].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[5]古強,劉志恒,黃英等.植物葉片內(nèi)生放線菌的分離、分類與拮抗活性[J].微生物學(xué)報,2006,46(5):778-782.

[6]Bacon CW,White JF.Microbial endophytes[M].New York:Marcel Dekker Inc.,2000.

[7]Strobel GA.Endophyte as sources of bioactive products[J].Microbes Infect,2003,5(6):535-544.

Study on Isolation of Endophytic Actinomycetes from Ranvolfia Yunnanensis Tsiang

HONGLiang1,X I E X iu-chao2,CHEN Shao-xing1,ZHANG Yong-li3,TAO Hong-zheng1,YANG Jian1＊
(1.College ofLife Sciences and Technology,Honghe University,Mengzi,661100,China;2.Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology,ShaanxiUniversity of Technology,Hanzhong 723001,China;3.Xishuangbanna TropicalBotanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Mengla 666303,China)

The aims of this study are to isolate endophytic actinomycetes from medicinal plant Ranvolfia Yunnanensis Tsiang.Root,stem,leaf,and friut of the sample was surface-sterilized by using ethanol and Sodium hypochlorite prior to the isolation of the actinomycetes.Two kindsof isolation medium named S M1 and OA and three kinds of isolation method were used to isolate and respectively supplemented with potassium dichromate.Seventeen strains were isolated.

Ranvolfia Yunnanensis Tsiang;endophytic actinomycetes;isolation

Q93

A

1008-9128(2010)02-0052-03

2010-03-28

云南省教育廳科研基金項目(07C11183),紅河學(xué)院博碩科研啟動項目(XSS07007、XSS07013)

洪亮(1982-),男,江西景德鎮(zhèn)人,碩士.研究方向:應(yīng)用微生物.

楊建(1980-),女,貴州遵義人,碩士.研究方向:應(yīng)用微生物.

[責(zé)任編輯 姜仁達]