孫子羽,遲乃玉,李 兵,王 宇,張慶芳

(1.大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622;

2.大連輕工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

生淀粉糖化酶高產(chǎn)菌株誘變選育

孫子羽1,遲乃玉1,李 兵1,王 宇2,張慶芳1

(1.大連大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116622;

2.大連輕工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

以細(xì)菌 Aeromonas.sp.CNY01為出發(fā)菌株,通過紫外 (UV)和硫酸二乙酯 (DES)誘變,獲得產(chǎn)酶較高的菌株 CNY01-27-13,酶活達(dá)到 98.42 U/mL,比原始菌株酶活提高了 110.52﹪,菌株經(jīng)過 9次傳代,酶活較穩(wěn)定。

生淀粉糖化酶,紫外誘變,DES誘變,突變株

生淀粉酶一般來說是指可以直接作用、水解或糖化未經(jīng)蒸煮淀粉顆粒的酶。它為哪一種酶,至今還沒有一個(gè)嚴(yán)格的定義,因此生淀粉酶所涉及的酶有好幾種,α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫枝酶中都有對(duì)生淀粉作用的成分[1-5],生淀粉糖化酶 (Raw Starch-digesting Glucoamylase,RSGA)是指那些能夠?qū)⒉唤?jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒直接水解成葡萄糖,進(jìn)而將傳統(tǒng)淀粉糖化 (糊化、液化、糖化)三步合一步完成的“葡萄糖淀粉酶”[6],具有良好的節(jié)能前景,如果將其應(yīng)用于無蒸煮的酒精發(fā)酵 ,可節(jié)約總能耗的 30%～40%[7]。本文報(bào)道了用傳統(tǒng)的誘變方法對(duì)一株生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌的選育工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

細(xì)菌 Aeromonas.sp.CNY01為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種

1.1.2 試劑

玉米生淀粉 (北京聯(lián)合華友商貿(mào)有限公司),3,5-二硝基水楊酸。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基:生淀粉 20 g,NaNO3 2 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O微量,K2HPO4 1.5 g,MgSO4·7H2O微量,瓊脂 20 g,水 1000 ml,自然 pH,1×105 Pa滅菌 30 min。其中生玉米淀粉在 105℃下干熱滅菌 2 h,然后在常溫下無菌操作加入。種子培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g,酵母膏 5 g,葡萄糖 1 g,K2HPO4 3 g,水 1000 ml,自然pH,1 ×105 Pa滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米生淀粉 20 g,NaNO3 3 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O微量,K2HPO4 2 g,MgSO4·7H2O微量,水 1000 ml,自然 pH;1×105 Pa滅菌 30 min。其中生玉米淀粉在 105℃下干熱滅菌 2 h,然后在常溫下無菌操作加入。

1.2 方法

1.2.1 酶活測(cè)定方法

2%的生淀粉懸浮液 2.0 mL加入到 25 mL具塞比色管,添加 pH5.4檸檬酸 -檸檬酸鈉緩沖液 2 mL,30℃預(yù)熱 10 min,加入 1.0 mL酶液,于 30℃恒溫振蕩 (180 r/min)反應(yīng) 10 min后,加入 DNS試劑 2 mL終止反應(yīng)。搖勻,置沸水浴中煮沸 5 min。取出后流水冷去,加蒸餾水定容至 20 mL。以不加酶液管作為空白調(diào)零點(diǎn),在 520 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值。酶活力單位的定義:在分析條件下 ,1 min釋放 1μg的還原糖 (以葡萄糖計(jì)算)所需的酶量定義為 1個(gè)酶活力單位。

1.2.2 誘變方法

菌懸液制備:用接種環(huán)挑取活化后的菌體于無菌的盛有玻璃珠的三角瓶中,充分振蕩15min,制成均勻的懸液,調(diào)整菌體濃度為 108個(gè)/mL。

紫外誘變:紫外燈 (30W)預(yù)熱 1 h,取 5 mL菌懸液注入直徑為 9 cm的培養(yǎng)皿中 (內(nèi)含無菌攪棒),置于磁力攪拌器上,在距離為 30 cm處攪拌照射不同時(shí)間。暗室冰浴 2 h,做梯度稀釋,選取適當(dāng)稀釋濃度涂選擇性平板,20℃避光培養(yǎng) 5 d,計(jì)算致死率,在不同照射時(shí)間挑選其中D/d值大且生長(zhǎng)快速的 10個(gè)誘變菌株,在發(fā)酵培養(yǎng)基中 20℃培養(yǎng) 36 h后,跟蹤測(cè)定酶活,計(jì)算正突變率[8,9]。

DES誘變:在 100 mL的三角瓶中加入 15 mL pH7.0的磷酸緩沖液和 5 mL菌懸液,再加入 0.2 mL DES溶液混勻,36℃恒溫震蕩處理不同時(shí)間。取 1 mL處理液,加入 1 mL 25﹪的Na2S2O3終止反應(yīng),將處理液適當(dāng)稀釋,取 0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基平板,20℃避光培養(yǎng) 5 d,計(jì)算致死率,在不同處理時(shí)間挑選其中 D/d值大且生長(zhǎng)快速的 10個(gè)誘變菌株,在發(fā)酵培養(yǎng)基中 20℃培養(yǎng) 36 h后,跟蹤測(cè)定酶活,計(jì)算正突變率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變

將菌懸液用紫外線分別照射 10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s和 70 s后 ,通過平板計(jì)數(shù)計(jì)算致死率,結(jié)果見圖 1,搖瓶發(fā)酵后計(jì)算正突變率,結(jié)果見圖 2。從圖 1和圖 2可以看出CNY01最佳正突變率 (44.5﹪)所對(duì)應(yīng)的致死率為 80.57﹪,即紫外燈照射時(shí)間為 30 s。

圖 1 UV誘變致死率曲線

圖 2 UV誘變正突變率曲線

經(jīng)紫外誘變得到的 9株酶活較高的菌株,結(jié)果見圖 3。有圖 3可知,編號(hào)為 CNY01-10和 CNY01-27的兩株菌酶活最高,其酶活力分別達(dá)到 65.3 U/mL和 63.27 U/mL。進(jìn)一步菌株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) CNY01-27要優(yōu)于 CNY01-10,所以選定 CNY01-27為再次誘變的出發(fā)菌株。

圖 3 紫外誘變后突變菌株酶活力

2.2 DES誘變

將以 CNY01-27為出發(fā)菌株的菌懸液用DES分別處理 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和 70 min后,通過平板計(jì)數(shù)計(jì)算致死率,結(jié)果見圖 4,搖瓶發(fā)酵后計(jì)算正突變率,結(jié)果見圖 5。從圖 4和圖 5可以看出CNY01-27最佳正突變率 (30.24﹪)所對(duì)應(yīng)的致死率為 87.67﹪,即 DES處理 20 min。

圖 4 DES致死率曲線

圖 5 DES誘變正突變率曲線

經(jīng) DES誘變處理得到 6株正突變菌株,結(jié)果見表 1。對(duì)這 6株菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn) CNY01-27-13連續(xù)傳代產(chǎn)酶比較穩(wěn)定,其結(jié)果見圖 6。

表 1 DES誘變后突變菌株酶活力

圖 6 CNY01-27-13菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性

由圖 6知,CNY01-27-13菌株產(chǎn)酶比較穩(wěn)定,測(cè)定的傳代酶活分別為 97.69 U/mL、99.5 U/mL、94.3 U/mL、98.35 U/mL和 95.8 U/mL,而其他 5株菌隨著傳代數(shù)的增加,酶活力下降幅度都比較大。所以最終選定CNY01-27-13作為以后發(fā)酵產(chǎn)酶的出發(fā)菌株。

3 結(jié)論

以本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株細(xì)菌Aeromonas.sp.CNY01為出發(fā)菌株,其初始酶活為 46.75U/mL,通過紫外誘變 (UV)得到菌株CNY01-27,其酶活達(dá)到 63.27 U/mL,比出發(fā)菌株提高了 35.34﹪;將菌株 CNY01-27再進(jìn)行硫酸二乙酯 (DES)誘變,獲得產(chǎn)酶較高的菌株 CNY01-27-13,酶活達(dá)到 98.42 U/mL,比出發(fā)菌株 CNY01-27酶活提高了 55.56%;相比而言,硫酸二乙酯 (DES)誘變要比紫外誘變(UV)效果顯著。選育得到的菌株經(jīng)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)表明有較好的遺傳穩(wěn)定性。

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Mutating of raw starch-digesting glucoamylase stra in

SUN Zi-Yu1,CH INai-Yu1,L IBing1,WANG Yu2,ZHANGQing-Fang1

(1.Bioengineering College,Dalian University,Dalian,11622,China;2.School of Biological and Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,116034,China)

A mutant strain CNY01-27-13 with high yied of raw starch-digesting glucoamylase was isolated from protoplast of Aeromonas.sp.CNY01 treated by UV and DES.The raw starch-digesting glucoamylase activity of the strain raised to 98.42 U/mL,which was 110.52%higher than the enzyme activity of protoplast strain.The enzyme activity of the mutant strain was very steady cultured by nine times.

raw starch-digesting glucoamylase,UV mutagenesis,DESmutagenesis,mutant

X172 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):

1008-2395(2010)06-0075-03

2010-10-23

張慶芳 (1965-),性別,女,副教授,Email:zhangqingfang@dlu.edu.cn