張立明，王云生,，高麗萍?，夏濤

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，合肥 230036；2.農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學與生物技術(shù)重點實驗室，合肥 230036）

SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，簡稱SDS電泳。它不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡便，能在幾小時內(nèi)得到結(jié)果，有較高的重復性，且不要非常純的樣品，是目前為大家所接受的用于測定亞基分子量的一種最好方法。這個方法可用于多肽分子量的分析，用于變性蛋白的分離以及僅溶解在離子去污劑中的膜蛋白和用層析方法分離的蛋白和酶的純化控制[1]。蛋白提取是進行蛋白質(zhì)組學研究的前提和基礎(chǔ),全葉蛋白的提取方法主要有冷丙酮沉淀法、TCA沉淀法、TCA-丙酮沉淀法、Tris-丙酮法等。目前，多種植物的鮮葉蛋白提取及分離都獲得了良好效果，如棉花葉蛋白[2]、水稻葉蛋白[3，4]、玉米葉蛋白[5]、楊樹葉蛋白[6]等。與懸浮細胞相比，植物組織樣品由于富含色素、酚、脂類、醌類、多糖及其他多種次生代謝物，因而較難獲取純凈的蛋白質(zhì)[7-9]。茶葉中含有大量的多酚類物質(zhì)(占干重18%～36%)[10]，它們與其他物質(zhì)一起，干擾SDS-PAGE分析，造成電泳結(jié)果不穩(wěn)定和蛋白電泳譜帶差異很大，電泳分析常不能獲得滿意的結(jié)果。

本實驗對茶樹鮮葉蛋白的提取和 SDS-PAGE的方法進行了比較，擬建立適合茶樹鮮葉蛋白提取和SDS-PAGE的方法，并利用建立的方法對茶樹鮮葉蛋白,不同處理蔗糖濃度處理的愈傷組織蛋白進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹 (Camellia sinensis(L.) O.Kuntze.var.sinensiscultivar Shuchazao) 鮮葉采自安徽農(nóng)業(yè)大學試驗茶園。茶樹愈傷組織為本實驗室篩選的“云莖63Y”。茶樹愈傷組織培養(yǎng)條件：以B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH5.5),25℃下暗培養(yǎng)，以21d為一個培養(yǎng)周期，蔗糖濃度為3%；茶樹愈傷組織“云莖63Y”蔗糖處理蔗糖濃度為7%，其余條件同茶樹愈傷組織培養(yǎng)條件[11]。

1.2 茶樹葉片蛋白質(zhì)的提取制備

1.2.1 TCA-丙酮沉淀法[12-15]

取0.5 g鮮葉，液氮冷凍，研磨至粉狀，加入0.5 g水不溶性PVP，10倍-20℃預冷的TCA-丙酮（含1mmol/L EDTA，10% TCA，和0.07%β-巰基乙醇）溶液，渦旋后靜置于-20℃下，沉淀蛋白過夜；離心(4℃, 15000×g,30min)，棄上清，沉淀再次懸浮于-20℃預冷的丙酮溶液(含0.07 %β-巰基乙醇)中2h，離心(4℃, 15000×g,30min)，重復3～4次；沉淀靜置于-20℃下24 h，充分揮發(fā)丙酮，制成蛋白丙酮干粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

準確稱取蛋白丙酮干粉50 mg，置于7 ml離心管中，加入1 ml裂解液(含9.5 mol/L Urea，2.0 %(V/V) NP-40(Nonidet P-40)，40 mmol/L DTT)，渦旋振蕩，37 ℃水浴1.5 h，離心(4℃, 15000×g,30min)，上清液用于蛋白質(zhì)電泳分析。蛋白質(zhì)含量檢測按照Ramagli改進的Bradford法[15]進行。

1.2.2 冷丙酮沉淀法[17]

丙酮取代TCA-丙酮進行蛋白沉淀，其余步驟同1.2.1。

1.2.3 TCA沉淀法[17]

利用 20%TCA進行蛋白沉淀。鮮葉液氮冷凍，研磨至粉狀，加入0.5g水不溶性PVP，10倍20%TCA后室溫下靜置過夜，其余步驟同1.2.1。

1.2.4 Tris-丙酮法[6]

取0.5 g鮮葉液氮冷凍，研磨至粉狀，加入0.5 g水不溶性PVP，4倍體積蛋白提取緩沖液（62.5 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，0.5 % SDS，10 %甘油和5 % β-巰基乙醇），渦旋震蕩，4℃下靜置過夜，離心(4℃, 15000×g,30min)，上清加入2.5倍體積-20℃預冷的丙酮溶液(含 0.07%β-巰基乙醇)，-20℃靜置 1 h，離心(4℃, 15000×g,30min)，重復3-4次；沉淀靜置于-20 ℃下24 h，充分揮發(fā)丙酮，制成蛋白丙酮干粉。-20℃保存?zhèn)溆?。加入上樣液?2.5% 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8,10%甘油，5%β-巰基乙醇，72.5%去離子水）溶解沉淀，沉淀充分溶解后，離心(4℃, 15000×g,30min)，取上清液即為待測蛋白溶液。蛋白質(zhì)含量檢測按照Bradford 法[18]進行。

1.3 茶樹蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳

1.3.1 凝膠制備及電泳

本實驗采用了連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳兩種方式進行電泳，連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳的分離膠濃度均為12.5%，不連續(xù)電泳的濃縮膠濃度為3.9%[19]。上樣前取待測蛋白溶液，按體積比1：1加入上樣緩沖液（100mmol/LTris-HCl，pH6.8，4%SDS，0.2%溴酚藍，200mmol/Lβ-巰基乙醇，20%甘油）?；靹虿⒃?5℃以上沸水中處理5min。點樣前離心（10000×g，5min），以減少蛋白質(zhì)條帶的拖尾現(xiàn)象[16]。

本實驗比較了采用高、低壓轉(zhuǎn)換的連續(xù)電泳法和不連續(xù)電泳法，在不連續(xù)電泳過程中，還比較了橫流和恒壓兩種方式，并且在濃縮膠中的電壓或電流都比分離膠中的小。在上樣前，先在恒壓150V或橫流35mA條件下預電泳30min。預電泳結(jié)束后在點樣孔中點入適量待測蛋白溶液，再按表1電泳參數(shù)分別進行電泳，直至溴酚藍離膠底1cm為止，時間約3.5h。

表1 電泳參數(shù)設(shè)定

1.3.2 染色及分析

電泳結(jié)束后，采用可兼容質(zhì)譜分析的銀染法[20]進行染色。染色結(jié)束后，立即對凝膠進行拍照，拍照后用BandScan5.0軟件進行相應(yīng)的處理分析，并結(jié)合蛋白分子量標準估算相應(yīng)蛋白條帶表觀分子量。

圖1 茶樹鮮葉四種蛋白提取方法的比較

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹葉片蛋白電泳體系的建立

2.1.1 不同蛋白提取方法的比較

本實驗比較了TCA-丙酮沉淀法、冷丙酮沉淀法、TCA沉淀法和Tris-丙酮法四種提取方法對茶樹鮮葉蛋白的提取效果，表2及圖1結(jié)果顯示四種提取方法存在較大差異，其中TCA-丙酮沉淀法的蛋白提取效果最好，不僅蛋白質(zhì)提取得率高，而且蛋白條帶多且清晰；其次是Tris-丙酮法，蛋白質(zhì)條帶清晰，雜質(zhì)少，但是蛋白的提取得率較低；其他兩種沉降方法，蛋白的提取得率低，雜質(zhì)較多，條帶少且不夠清晰。利用優(yōu)化的TCA-丙酮沉淀法，提取愈傷組織“云莖63Y”的蛋白含量為14.6 mg/gFW，也取得了良好的電泳效果（見圖2，B1）,說明TCA-丙酮沉淀法也適合茶樹愈傷組織蛋白的提取。

為了減少茶樹鮮葉當中的雜質(zhì)對電泳的干擾，在林金科等[16]的茶葉蛋白提取方案中，蛋白丙酮干粉經(jīng)過了裂解液溶解、上清液經(jīng)預冷丙酮（含5mmol/Lβ-Me）再沉淀，沉淀再用裂解液復溶的過程，本實驗通過比較發(fā)現(xiàn)（圖2），該方案會使蛋白含量損失很多（用丙酮重沉淀再溶解后的蛋白量為重沉淀前的1/3），但由于茶樹鮮葉中含有的多酚類等雜物質(zhì)較多，通過丙酮重沉淀會使雜物含量降低，并且對茶樹鮮葉蛋白條帶數(shù)的影響不大。而茶樹愈傷組織含有的雜質(zhì)要遠遠低于茶樹鮮葉，不用丙酮重沉淀即可，丙酮重沉淀會使低于40KD蛋白分子條帶顏色變淺或條帶缺失。

圖2 冷丙酮重沉淀蛋白液對電泳條帶影響的SDS-PAGE電泳圖

表2 四種提取方法對茶樹鮮葉蛋白質(zhì)提取的影響

2.1.2 不同電泳方式的比較

SDS-PAGE垂直板電泳分為只有分離膠的連續(xù)電泳和帶有濃縮膠的不連續(xù)電泳。濃縮膠的孔徑要遠遠地大于分離膠的孔徑，由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳[1]。顏廷進等人[21]使用連續(xù)電泳，先將電壓設(shè)為低電壓進行電泳，待蛋白形成單一的界面層后再改設(shè)高壓進行電泳，通過這種高、低壓轉(zhuǎn)換法取得了良好的電泳效果。本實驗比較了采用高、低壓轉(zhuǎn)換的連續(xù)電泳法和不連續(xù)電泳法，在不連續(xù)電泳的過程中，還比較了橫流和恒壓兩種方式(圖3)。結(jié)果表明，不連續(xù)電泳比連續(xù)電泳的蛋白質(zhì)分離效果好，條帶清晰，條帶數(shù)多。對于不連續(xù)電泳的恒壓和橫流兩種方式，通過比較發(fā)現(xiàn)這兩種方式的條帶數(shù)差別不大，但在條帶清晰度上，恒壓要好于橫流。

圖3 連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳SDS-PAGE電泳圖譜的比較

另外，我們還比較了不同分離膠濃度（11%，12%，12.5%，13%）、不同濃縮膠濃度（5%，3.9%）的影響，發(fā)現(xiàn)比較適宜的分離膠濃度為 12.5%，濃縮膠濃度為3.9%。

2.2 用優(yōu)化的方法分析蔗糖濃度對“云莖63Y”愈傷組織蛋白質(zhì)表達的影響

蔗糖是主要的誘導植物細胞積累次生產(chǎn)物的因子之一。為了研究茶樹愈傷組織兒茶素合成的調(diào)控，我們研究了蔗糖濃度對“云莖 63Y”愈傷組織兒茶素合成代謝的影響。以 3%蔗糖濃度為對照，7%蔗糖濃度處理一周期后，利用優(yōu)化的蛋白提取和電泳方法比對了蔗糖誘導前后“云莖 63Y”的蛋白表達的差異，結(jié)果見圖4。比對圖譜分析發(fā)現(xiàn)，7%蔗糖處理后蛋白表達產(chǎn)生變化，分子量在 28kD～33kD間有幾處明顯差異條帶。利用BandScan 5.0軟件進行分析，差異條帶的特性見表3。

圖4 蔗糖處理對“云莖63Y”愈傷組織蛋白表達的影響

表3 蔗糖處理對“云莖63Y” 愈傷組織蛋白表達的影響

3 討論

本實驗通過比較研究，確立了適合茶樹鮮葉蛋白的提取、定量、凝膠制備、電泳、凝膠染色技術(shù)。樣品制備是電泳成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，茶樹當中含有大量的多酚類、色素和其他物質(zhì)，這些成分使SDS-PAGE分析受到了很大的干擾，電泳分析常不能獲得滿意的結(jié)果，通過對茶樹鮮葉蛋白的提取及SDS-PAGE方法進行比較，結(jié)果表明TCA-丙酮沉淀法可以有效避免茶樹鮮葉中的雜物對蛋白的影響，適合茶樹鮮葉蛋白的提取，并且在茶樹愈傷組織蛋白的提取中也取得了良好效果。

本實驗在研究過程還做了如下改進：(1)為了減少多酚類等雜物的影響，在提取過程中加大水不溶性PVP的量，在實驗中按鮮葉鮮重1：1加入PVP，去除多酚類物質(zhì)對電泳的干擾。(2)利用液氮充分研磨鮮葉，在液氮剛散去時，應(yīng)立即加入蛋白提取液；為了盡可能地消除蛋白酶對蛋白的降解，在提取液中加入蛋白酶抑制劑EDTA。(3)對于蛋白濃度的測定，一般采用Bradford法，該法是根據(jù)考馬斯亮藍G-250和蛋白質(zhì)的結(jié)合來定量的，但裂解液中含有的尿素，會影響G-250和蛋白的結(jié)合。為了消除尿素的影響，在蛋白含量測定時采用的是Ramagli改進了的Bradford法。該方法在標準曲線繪制和樣品濃度測定中，先用0.1mol/L的鹽酸來中和樣品，這樣會使測定的結(jié)果更為準確。(4)濃縮膠對于提高蛋白分辨率起著至關(guān)重要的作用，操作中再結(jié)合高低電壓交替，在濃縮膠中采用低電壓，分離膠中采用較高電壓進行電泳可以起到更好的蛋白分離效果。(5)電泳實驗中，通常采用的是恒壓和橫流兩種參數(shù)設(shè)定，蛋白在膠中遷移的速率是與電壓成正比的，在電泳的過程中，整個電路會產(chǎn)生大量的熱，使電路的電阻變大，若采用橫流的方式進行電泳，會使整個電路的電壓逐漸變大，造成蛋白的速率越來越大，極大地降低分辨率，若采用恒壓的方式進行電泳會避免這種情況的出現(xiàn)。

通過多次重復試驗，發(fā)現(xiàn)利用該蛋白提取及電泳方法，提取的蛋白量大，分離的蛋白雜質(zhì)少，條帶多、清晰，而且重復性和穩(wěn)定性良好。利用這一優(yōu)化方法對不同蔗糖濃度處理的愈傷組織蛋白進行了研究，找到了差異條帶，為進一步進行茶樹鮮葉和茶樹愈傷組織的蛋白質(zhì)組學研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)[M].北京:科學出版社, 2001,141～144,66.

[2]沙月霞,簡桂良等.棉葉總蛋白提取及SDS-PAGE電泳的改良[J].棉花學報,2005,17(3):146～150.

[3]王玉琪,彭新湘.適用于水稻葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)[J].植物生理與分子生物學學報,2006, 32 (2): 252～256.

[4]鐘伯雄.水稻蛋白質(zhì)雙向電泳分析新方法[J].浙江農(nóng)業(yè)大學學報,1997,23(2):128～132.

[5]李冠軍,付鳳玲.玉米葉片總蛋白提取和雙向電泳技術(shù)的改進玉米科學[J].2006,14(6):100～103.

[6]谷瑞升,劉群錄,陳雪梅,等.木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比較和優(yōu)化[J].植物學通報,1999,16(2):171～177.

[7]徐幼平,徐秋芳,蔡新忠.適于雙向電泳分析的番茄葉片總蛋白提取方法的優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2007,19(2):71～74.

[8]Granier F.Extraction of Plant Proteins for Two2dimensional Electrophoresis [J].Electrophoresis,1988,9: 712～718.

[9]Canovas F M,Dumas-Gaudo T E ,Recorbet G,Jonrrin J.Plant proteome analysis[J].Proteomics,2004 ,4 (2) :285～298.

[10]宛曉春.茶葉生物化學[M],北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003(第三版),9～10.

[11]劉亞軍,高麗萍,夏濤,高可君.茶懸浮培養(yǎng)細胞玻璃化超低溫保存研究[J],茶葉科學,2009,29(2):120～126.

[12]Saravanan R S , Rose J K C.A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomics ,2004, 4:2522～2532.

[13]Damerval C, Vienne D, ZivyM, et al.Technical Imp rovements in Two-dimensional Electrophoresis Increase the Level of Genetic Variation Detected inWheat-seedling Proteins [J].Electrophoresis,1986, 7: 52～54.

[14]王鳳茹.雙向凝膠電泳應(yīng)注意的幾個關(guān)鍵問題[J].生物技術(shù)通報,2005,(6):62～64.

[15]林金科,鄭金貴,袁明,張學琴,等.茶樹蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的改良方法[J].茶葉科學,2003,23(1):16～20.

[16]夏其昌,曾嶸等.蛋白質(zhì)化學與蛋白質(zhì)組學[M],北京:科學出版社,2004, 91,278～279.

[17]錢小紅,賀福初.蛋白質(zhì)組學：理論與方法[M],北京:科學出版社,2003,50～52.

[18]王學奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M], 北京:高等教育出版社,2006(第二版),190-192,159, 169～170.

[19]J.S.博尼費斯?jié)獾?精編細胞生物學實驗指南[M],北京:科學出版社,2007,509～510.

[20]Berkelman T, Stenstedt T.2-D Electrophoresis Principles and Methods[J].Uppsala:Handbooks from Amersham Biosciences,1998, 87.

[21]顏廷進,李群,楊平平,等.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)的改良及其應(yīng)用效果[J].山東農(nóng)業(yè)科學,1998,5:19～21.