盧美萍， SONG Xiu－yuan， MENG Qing－h(huán)e

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州310003;2 Department of Pathology and Laboratory Medicine，College of Medicine，University of Saskatchewan，103 Hospital Drive，Saskatoon，SK，S7N 0W8，Canada)

I 型糖尿病是嚴(yán)重危害人類身心健康的常見慢性病之一。氧化應(yīng)激及過氧化損傷是糖尿病及其并發(fā)癥的始動因素之一。甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)為人體內(nèi)糖代謝產(chǎn)生的毒性副產(chǎn)物，是較強(qiáng)活性的氧自由基之一，參與疾病的氧化損傷作用。近年來研究表明MG 與糖尿病及其慢性并發(fā)癥密切相關(guān)，有可能是糖尿病并發(fā)癥治療的新靶點(diǎn)［1，2］。大豆異黃酮(isoflavone)是從大豆中分離提取出來并具有多種生物學(xué)功能的天然生物活性物質(zhì)，具有抗氧化作用，可降低糖尿病病人的血糖、血脂水平，對糖尿病具有治療作用［3，4］，但確切機(jī)制尚未完全明了。本研究將通過建立I 型糖尿病大鼠模型，以含不同劑量大豆異黃酮的飼料喂養(yǎng)，以探討大豆異黃酮對血清MG 水平及糖尿病性白內(nèi)障并發(fā)癥的影響，旨在為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD 大鼠，體重200－250 g，年齡6 周，購自加拿大魁北克省(Charles River，Constant，Quebec，Canada)。動物實(shí)驗(yàn)遵循薩斯喀徹溫大學(xué)動物倫理委員會原則。參照文獻(xiàn)［5］制備I 型糖尿病大鼠模型，先將鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma Chemical Co.)溶解在0.01 mol/L 的檸檬酸鈉溶液(pH 4.5)制成STZ 檸檬酸鈉溶液以備用。用血糖自動分析儀(Glucometer Elite XL)在STZ 注射前先測定大鼠空腹基礎(chǔ)血糖值，分別在實(shí)驗(yàn)第1、3、5 d 按100 mg/kg STZ 檸檬酸鈉溶液經(jīng)腹腔注射入大鼠，第7 d 再次測定空腹血糖值，大鼠血糖>16 mmol/L 確定為糖尿病用于本實(shí)驗(yàn)。

2 大鼠喂養(yǎng)及大豆異黃酮的干預(yù)

糖尿病大鼠模型建立后，隨機(jī)分為3 組(n =9)，分別接受不同劑量大豆異黃酮的特殊大鼠飼料喂養(yǎng):高劑量組(high dose of isoflavone soy protein + diabetes，diabetes+HIS)，低劑量組(low dose of isoflavone soy protein + diabetes，diabetes+LIS)及不含大豆異黃酮的飼料喂養(yǎng)組(diabetes)，3 組大鼠之間比較，其體重、基礎(chǔ)血糖值及STZ 注射后第7 d 空腹血糖值均無顯著差異。3 種大鼠飼料除大豆異黃酮來源的蛋白質(zhì)含量不同外，其余的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素的百分比均完全一致［6］，具體的飼料成分見表1。治療后每周監(jiān)測空腹血糖1次。治療8 周后，饑餓24 h，苯巴比妥鈉240 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉處死大鼠，腹主動脈穿刺收集動脈血，離心吸取血清，分裝，－80 ℃保存用于檢測。

表1 含不同劑量大豆異黃酮的大鼠飼料成分Table 1. Ingredients of experimental diets(g/kg)

3 生化及ELISA 法檢測

生化儀器Synchron LX20 (Beckman)測定血糖、離子交換HPLC (Bio－Rad Variant II)法測定血清糖化血紅蛋白水平，根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法檢測血清還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平。用ELISA 法參照操作說明檢測血清胰島素水平。

4 HPLC 法測定血清甲基乙二醛水平

25 μL 血清冰上用1/4 體積的高氯酸(perchloric acid，PCA)孵化10 min，12 000 ×g 離心15 min，棄去PCA 沉淀物，上清液加上100 mmol/L 鄰苯二胺，室溫孵化3 h。HPL 通過Nova－Pak? C18 柱(3.9 mm×150 mm，和4 μm 微粒直徑)測定甲基乙二醛的喹喔啉衍生物(2－甲基喹喔啉)和5－2－甲基喹喔啉水平。

5 免疫組化法測定胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平

大鼠處死后取部分胰腺組織，用4%甲醛固定12 h，石蠟包埋，切片用于免疫組化染色。DakoCytomation 試劑盒(Dako，Mississauga，ON，Canada)用于檢測胰島β－cells 中胰島素表達(dá)情況。操作步驟按照試劑盒說明書。簡述如下:切片經(jīng)1/500 稀釋的豬抗多克隆抗體(Cat. No. A0064，Dako，Mississauga，ON，Canada)孵化，加入兔抗豬生物素免疫球蛋白Ⅱ抗結(jié)合并洗滌，Ultraview DAD 檢測試劑盒顯影(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)，蘇木素用于染色并計(jì)數(shù)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大豆異黃酮對血糖、血清糖化血紅蛋白水平的影響

與diabetes+LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血糖明顯降低［(19.50 ±1.85)mol/L vs(28.24 ±3.56)mol/L or (26.94 ±1.82)mmol/L，均P<0.05］，血清糖化血紅蛋白明顯下降［(13.14 ±3.00)% vs (17.16 ±2.60)% or (17.29 ±4.12)%，均P <0.05］。Diabetes +LIS 與模型組比較，血糖、血清糖化血紅蛋白水平均無顯著差異，見表2。

表2 大豆異黃酮對血糖、血清糖化血紅蛋白和胰島素水平的影響Table 2. Effects of soy isoflavones on serum levels of glucose，HbA1c or insulin in diabetic rats(±s)

表2 大豆異黃酮對血糖、血清糖化血紅蛋白和胰島素水平的影響Table 2. Effects of soy isoflavones on serum levels of glucose，HbA1c or insulin in diabetic rats(±s)

* P<0.05，**P<0.01 vs diabetes;#P<0.05，##P<0.01 vs diabetes+LIS.

Group n Glucose(mmol/L)HbA1c(%)Insulin(μg/L)Diabetes 7 26.94±1.82 17.16±2.60 0.39±0.04 Diabetes+LIS 7 28.24±3.56 17.29±4.12 0.55± 0.04 Diabetes+HIS 9 19.50±1.85* # 13.14±3.00* # 2.46±0.35**##

2 血清胰島素及胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平改變

與diabetes +LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血清胰島素水平明顯升高［(2.46 ±0.35)μg/L vs (0.55 ±0.04)μg/L or (0.39 ±0.04)μg/L，均P <0.01］，見表2，diabetes +HIS 組大鼠胰島β 細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平也明顯增加，見圖1;diabetes+LIS 與模型組比較，血清胰島素及胰島β細(xì)胞中胰島素表達(dá)水平均無顯著差異。

Figure 1. Histology of pancreas and insulin immunohistostaining (×200).A:STZ－induced diabetes;B:diabetic rats were treated with LIS protein (diabetes+ LIS);C:diabetic rats were treated with HIS protein(diabetes+HIS). Significantly increased insulin production was observed in rats of diabetes+HIS group compared to the diabetes group (A)or diabetes+LIS group(B).圖1 免疫組化顯示胰腺組織及胰島素表達(dá)情況

3 血清MG 和GSH 水平的變化

與diabetes+LIS 和模型組大鼠比較，diabetes +HIS 組大鼠血清MG 水平明顯降低［(0.77 ±0.09)nmol/L vs (1.57 ±0.17)nmol/L or (1.91 ±0.28)nmol/L，均P <0.05］，而血清GSH 水平明顯增加［(13.26 ±1.61)mmol/L vs (7.35 ±1.55)mmol/L or(5.54 ±1.10)mmol/L，均P <0.01］。Diabetes +LIS 與模型組比較，血清MG 和GSH 水平無顯著差異，見表3。

表3 大豆異黃酮對血清MG 和GSH 水平的影響Table 3. Effects of soy isoflavones on serum levels of MG or GSH in diabetic rats(±s)

表3 大豆異黃酮對血清MG 和GSH 水平的影響Table 3. Effects of soy isoflavones on serum levels of MG or GSH in diabetic rats(±s)

* P<0.05，**P<0.01 vs diabetes;#P<0.05，##P<0.01 vs diabetes+LIS.

Group n MG(nmol/L) GSH (mmol/ L)Diabetes 7 1.91 ±0.28 5.54 ±1.10 Diabetes+LIS 7 1.57 ±0.17 7.35 ±1.55 Diabetes+HIS 9 0.77 ±0.09* # 13.26 ±1.61**

4 各組大鼠死亡情況及白內(nèi)障的發(fā)生情況

在實(shí)驗(yàn)中，diabetes + HIS 組所有大鼠均存活，而模型組和diabetes+LIS 組分別在第5 周和第6 周出現(xiàn)死亡大鼠，至第8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，死亡率均為22%，見表4。白內(nèi)障經(jīng)裂隙燈檢查確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［8］。對照組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生率在第4 周為11%，第8 周達(dá)86%。Diabetes+LIS 組和diabetes+HIS 組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生分別開始于第6 周和第7 周，發(fā)生率分別為29%和22%，第8 周diabetes +LIS 組上升至43%。Diabetes+HIS 組大鼠白內(nèi)障的發(fā)生率明顯低于對照組，見表5。

表4 大豆異黃酮對糖尿病大鼠死亡的影響Table 4. Effects of isoflavones on the death rate in STZ－induced diabetic rats(%. n=9)

表5 大豆異黃酮對糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生率的影響Table 5. Effects of isoflavones on incidence of cataract in STZ－induced diabetic rats(%)

討 論

胰島β 細(xì)胞破壞、胰島素分泌不足是I 型糖尿病發(fā)生的主要原因。糖化血紅蛋白是糖尿病控制的良好指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，高劑量大豆異黃酮治療可增加糖尿病大鼠胰島β 細(xì)胞胰島素表達(dá)，提高血清胰島素和GSH 水平，降低糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋水平，減少M(fèi)G 產(chǎn)生，而且，高劑量大豆異黃酮治療還可減少糖尿病大鼠白內(nèi)障并發(fā)癥的發(fā)生。

大豆異黃酮是一類從大豆中分離提取出來并具有雌性激素樣作用的天然生物活性物質(zhì)，共包括12種化合物，約占全大豆的0.2%－0.4%。其具有降低總膽固醇、抗動脈粥樣硬化、提高機(jī)體免疫力、抗菌消炎、抗衰老、抗溶血等多種特殊生理功能;大豆異黃酮獨(dú)特的保健功能及防治多種疾病的作用已受到世人的普遍關(guān)注。近年來的研究表明，大豆異黃酮可通過改善抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化機(jī)制，發(fā)揮對糖尿病的降血糖、降血脂等治療作用［3，4，9，10］。本研究也顯示大豆異黃酮可降低糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋水平，而血清胰島素水平及胰島β 細(xì)胞胰島素表達(dá)水平明顯上升，表明其降血糖作用還可能與大豆異黃酮促進(jìn)胰島β 細(xì)胞功能恢復(fù)、使血清胰島素水平上升有關(guān)，以往研究也顯示大豆異黃酮可通過抑制胰島細(xì)胞凋亡、提高免疫功能等途徑促進(jìn)胰島β 細(xì)胞功能恢復(fù)［11］。但是，關(guān)于大豆異黃酮對糖尿病體內(nèi)MG 水平的影響及對糖尿病性白內(nèi)障的預(yù)防作用，在國內(nèi)外少有報(bào)道。

MG 作為非酶糖化反應(yīng)中間體，是人體內(nèi)糖代謝產(chǎn)生的一種毒性副產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的氧自由基活性作用。氧化應(yīng)激、過氧化損傷是糖尿病并發(fā)癥的始動因素［1，2］。MG 在糖尿病患者血循環(huán)中大量積累，與氨基酸殘基發(fā)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和交聯(lián)，使各種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化，許多長壽蛋白質(zhì)如膠原蛋白隨著糖化時(shí)間延長而不斷糖化，形成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)堆積，而AGEs 形成過程中又不斷產(chǎn)生氧自由基。氧自由基過量產(chǎn)生則抑制GAPDH 活性、使3－磷酸甘油醛增加，并分解產(chǎn)生AGEs 前體分子MG，如此形成氧化應(yīng)激、過氧化損傷的惡性循環(huán)。近年來關(guān)于MG 與糖尿病關(guān)系的研究越來越多。長期MG 高濃度可促進(jìn)糖尿病患者并發(fā)眼病、腎病、心血管疾病、神經(jīng)性病變，白內(nèi)障和老化等多種糖尿病并發(fā)癥，其機(jī)制可能與MG 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，近年來不少學(xué)者認(rèn)為MG 是糖尿病并發(fā)癥治療的新靶點(diǎn)［2，12，13］。本研究結(jié)果顯示，大豆異黃酮可減少糖尿病大鼠糖代謝產(chǎn)物MG 形成，機(jī)制可能與大豆異黃酮治療后大鼠體內(nèi)血糖水平下降有關(guān)，體內(nèi)血糖濃度下降可減少糖代謝產(chǎn)物MG 形成;同時(shí)，MG 下降還與大豆異黃酮治療后大鼠體內(nèi)GSH 產(chǎn)生增多有關(guān):GSH 作為抗氧化劑可減少M(fèi)G 形成，GSH還可能與體內(nèi)MG 結(jié)合，增加MG 的清除。

糖尿病高血糖可累及人體多臟器和多系統(tǒng)，引起心、腎、腦、眼、周圍血管、神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥［14，15］，其并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病致殘率和病死率升高的主要原因。在眼部，糖尿病性白內(nèi)障與糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的常見并發(fā)癥，而糖尿病性白內(nèi)障是首要的致盲因素。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制主要:(1)糖代謝異常通路(醛糖還原酶)學(xué)說;(2)氧化應(yīng)激(非酶性糖基化反應(yīng))學(xué)說。在糖尿病患者的高血糖環(huán)境下，MG 濃度增加。生物體內(nèi)的高M(jìn)G 濃度可引發(fā)蛋白質(zhì)和核酸修飾以及細(xì)胞毒性。MG 通過修飾眼晶體的分子伴侶蛋白導(dǎo)致眼晶體的透性降低甚至喪失，從而引起白內(nèi)障等眼病發(fā)生［2，12，13，16］。因此，早期阻斷MG 生成或者促進(jìn)其代謝是治療糖尿病并發(fā)癥的重要策略之一。我們研究顯示，大豆異黃酮可減少糖尿病大鼠MG 形成，減少糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生率。

綜上所述，大豆異黃酮對STZ 誘導(dǎo)的I 型糖尿病大鼠不但有降血糖作用，還可減少糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生，機(jī)制可能與大豆異黃酮減少M(fèi)G 產(chǎn)生、增加GSH 形成及抗氧化作用有關(guān)。因此，本研究為大豆異黃酮治療糖尿病及預(yù)防糖尿病并發(fā)癥如糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生提供了依據(jù)。

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