徐曉波, 蔣冬花, 李 杰, 后家衡

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

酵母菌是一類十分重要的微生物,對(duì)其分類與鑒定是人類開發(fā)利用酵母菌的基礎(chǔ).傳統(tǒng)的酵母菌種鑒定主要依據(jù)其形態(tài)特征,尤其是生理特征,但是這些特征易受培養(yǎng)條件等影響而出現(xiàn)不確定的結(jié)果.近年來,DNA分子標(biāo)記技術(shù)的引入給微生物分類鑒定產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用,使其分類鑒定工作由一般的表型特征鑒定深化到分子水平和遺傳型特征的鑒定[1].

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間 (ISSR)標(biāo)記技術(shù)是由 Zietkiewicz等[2]提出的,該技術(shù)檢測(cè)的是 2個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)之間的一段短DNA序列上的多態(tài)性[3].ISSR技術(shù)的基本原理就是利用真核生物基因組中廣泛存在的 SSR序列,設(shè)計(jì)出各種能與 SSR序列結(jié)合的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)引物,對(duì) 2個(gè)相距較近、方向相反的 SSR序列之間的DNA區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增.一般在引物的 5′或 3′端接上 2～4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基,以對(duì)具有相同重復(fù)形式的許多 SSR座位進(jìn)行篩選,使得最終擴(kuò)增出的 ISSR片段不會(huì)太多[4-6].ISSR技術(shù)所用的 PCR引物長(zhǎng)度在 20個(gè)核苷酸左右,因此可以采用與常規(guī) PCR相同的反應(yīng)條件,該技術(shù)克服了限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP)標(biāo)記、SSR標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記 (RAPD)的技術(shù)限制,具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高、模板 DNA用量少等優(yōu)點(diǎn)[7-10].目前,ISSR分子標(biāo)記在植物上應(yīng)用較為廣泛,但在微生物中的應(yīng)用還不多,將 ISSR分子標(biāo)記用在酵母菌種的分子鑒定中尚未見有報(bào)道.

本研究應(yīng)用 ISSR標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的 19株待鑒定的酵母菌進(jìn)行了分子標(biāo)記鑒定,檢測(cè)這種分子標(biāo)記技術(shù)用于酵母菌菌種鑒別的可行性,為酵母菌的遺傳分析和分類研究提供DNA水平的證據(jù).

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

從梨、蘋果、葡萄、獼猴桃等水果表皮的不同部位,以及果園土、泡菜、酒曲等中分離篩選得到 19個(gè)酵母菌菌株,分別進(jìn)行編號(hào)為 Y-1-Y-19.

用于 ISSR-PCR反應(yīng)的 dNTPs,Taq DNA聚合酶及 DL 2000TMDNA Marker均購自寶生物工程 (大連)有限公司.從 100條 ISSR引物中選取了 27條引物進(jìn)行試驗(yàn),引物 (其序列見表 1)由上海生工生物技術(shù)有限公司合成.

表 1 ISSR標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的引物序列

1.2 基因組 DNA的提取

使用 TI ANamp Yeast DNA Kit提取酵母菌基因組 DNA,試劑盒購于北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司.用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA的質(zhì)量,通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA的濃度和純度,并將 DNA溶液稀釋至 50 ng/μL.

1.3 引物的篩選

[11-12].用 27條 ISSR引物對(duì)釀酒酵母 (Saccharom yces cerevisiae)進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),從中篩選出帶形清晰、多態(tài)性豐富的引物.擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25μL,含 50 ng模板 DNA,50 ng引物,1.0μL dNTPs溶液 (2.5 mmol/L),1.5μL MgCl2溶液 (25 mmol/L),1.0 U Taq DNA聚合酶,1×PCR緩沖液.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 30 s,52℃退火 45 s,72℃延伸 90 s,擴(kuò)增 45個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min.

1.4 PCR正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn) [13-15].采用 L9(34)正交法,對(duì)影響 ISSR-PCR擴(kuò)增的主要因素:Mg2+,dNTPs,引物和Taq DNA聚合酶設(shè)計(jì) 4因素 3水平的正交試驗(yàn),方案見表 2和表 3.反應(yīng)體系總體積為 25μL,包括 1×PCR緩沖液,50 ng模板 DNA,其他各成分按照表 2加樣,最后用重蒸餾水 (ddH2O)補(bǔ)足.每個(gè)處理做 2次重復(fù).

反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物在 1.5%的瓊脂糖凝膠中 120 V電泳 1 h,在含有 0.5μg/mL EB(溴化乙錠)的染色液中染色后,置凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照分析.

表 2 ISSR-PCR體系各因素和水平

表 3 ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) (L9(34))

1.5 退火溫度和模板DNA濃度的篩選

根據(jù)正交試驗(yàn)找出最佳組合后,使用梯度 PCR,在 48～55℃進(jìn)行退火溫度的篩選,選出最佳的退火溫度.利用 ISSR-PCR的最佳組合進(jìn)行 DNA濃度對(duì) ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響試驗(yàn),25μL反應(yīng)體系中模板設(shè) 10,20,30,40,50,60,70,80和 90 ng共 9個(gè)處理.2個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的引物均為 UBC809.

1.6 DNA多樣性聚類分析

參照文獻(xiàn)[16].以最適條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得擴(kuò)增圖譜,根據(jù)同一位點(diǎn)帶的有無編成 1,0矩陣輸入計(jì)算機(jī),用 NTSYSpc軟件中的 SI MQUA I程序計(jì)算菌株間的相似系數(shù),最后用UPG MA法進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建相似聚類樹狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

ISSR技術(shù)中很重要的步驟是對(duì)引物的篩選,合適的引物是擴(kuò)增高產(chǎn)量、高分辨率分子標(biāo)記的前提.用 27條 ISSR引物對(duì)酵母菌株進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果見圖 1,其中 UBC807(1),UBC808(2),UBC809(3),UBC810(4),UBC811(5),UBC835(15),UBC836(16),UBC841(18),UBC842(19)和UBC857(23)共 10條引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、重復(fù)性和穩(wěn)定性好,且多態(tài)性條帶相對(duì)較多,故選用這 10條引物進(jìn)行19個(gè)未知酵母菌株的 ISSR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).

圖 1 ISSR引物篩選結(jié)果

2.2 PCR正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少做直觀分析.PCR的擴(kuò)增結(jié)果是 dNTP,引物,Mg2+和 Taq酶等因素綜合作用的結(jié)果.從圖 2可以看出:在 9個(gè)處理中,由于受 4個(gè)因素的濃度及組合不同的影響,擴(kuò)增結(jié)果也存在明顯的差異.通過比較發(fā)現(xiàn),組合 2擴(kuò)增的譜帶不但多態(tài)性好,且譜帶清晰,是最理想的組合.本實(shí)驗(yàn)確定 2號(hào)組合為最佳組合,即 25μL PCR反應(yīng)體系中含:150μmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,0.4μmol/L ISSR引物和 1U Taq酶.

2.3 退火溫度對(duì) ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響

利用 PCR正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳組合 2,引物選擇 UBC809,使用梯度 PCR法,在 48～55℃進(jìn)行退火溫度的篩選,結(jié)果見圖 3,通過比較得出最佳的退火溫度為 52～54℃.

圖 3 退火溫度對(duì) ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響

圖 2 正交設(shè)計(jì) ISSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果

2.4 模板 DNA用量對(duì) ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響

圖 4 模板 DNA用量對(duì) ISSR擴(kuò)增結(jié)果的影響

利用 PCR正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳組合2,在 25μL反應(yīng)體系中,設(shè) DNA含量分別為 10,20,30,40,50,60,70,80和 90 ng共 9個(gè)處理,引物選擇 UBC809,擴(kuò)增結(jié)果如圖 4.結(jié)果表明:DNA模板的適宜用量有一個(gè)較大的范圍,電泳條帶差異不明顯,DNA用量在 10～80 ng均可擴(kuò)增出條帶.本實(shí)驗(yàn)最終選擇在 25μL反應(yīng)體系中DNA的用量為 50 ng.

2.5 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

在最適的 ISSR擴(kuò)增條件下,對(duì)供試的 19株酵母菌 DNA進(jìn)行了 10條引物的ISSR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),經(jīng)重復(fù)試驗(yàn) (3次)擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定.部分引物對(duì)供試菌株的擴(kuò)增結(jié)果見圖 5.

10條引物共擴(kuò)增出 108條帶,其中 90.7%呈多態(tài)性 (見表 4).Y-5酵母的 ISSR擴(kuò)增圖譜與其他菌株的圖譜差異較大,擴(kuò)增的條帶較多.在后面的聚類分析中,以上述 10個(gè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物圖譜為依據(jù),對(duì)供試的 19個(gè)酵母菌株進(jìn)行聚類分析.

圖 5 部分引物對(duì) 19株酵母菌的擴(kuò)增結(jié)果

表 4 19株酵母菌 ISSR擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)

2.6 ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚類分析

采用 NTSYSpc軟件中的 SI MQUA I程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算兩兩菌株間的遺傳相似系數(shù).從不同水果表皮和自然環(huán)境中分離得到的 19株酵母菌的遺傳相似系數(shù)為 0.48～1.00,最小的是酵母Y-18與其他酵母的相似系數(shù) (0.48),相似系數(shù)最高的是酵母 Y-16和 Y-17,Y-9和 Y-13,兩者的相似系數(shù)都達(dá)到了1.00.

如圖 6所示,在相似水平為 0.61處,19個(gè)酵母菌株可以劃分為 3個(gè)群,第Ⅰ群:Y-1,Y-2,Y-5,Y-6,Y-19,Y-8,Y-16,Y-17,Y-9,Y-13,Y-3,Y-4,Y-7;第Ⅱ群:Y-10,Y-11,Y-12,Y-14,Y-15;Y-18酵母單獨(dú)代表一個(gè)群.

3 討 論

ISSR分子標(biāo)記多態(tài)性水平高,易于分析,不受環(huán)境影響,在品種鑒定中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[17].ISSR引物為重復(fù)序列,由于重復(fù)序列在基因組中是變異最快的成分,不受或很少受到自然選擇的影響,故其變異保留下來,所以重復(fù)序列區(qū)域的多態(tài)性遠(yuǎn)高于基因區(qū)域的多態(tài)性,這是 ISSR標(biāo)記多態(tài)性較高的原因所在[18].

本實(shí)驗(yàn)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,初步建立并優(yōu)化了酵母菌 ISSR分子標(biāo)記的 PCR反應(yīng)體系,這一反應(yīng)體系受諸多因素的影響,包括 Taq酶,Mg2+,dNTP,引物和模板 DNA濃度,以及退火溫度都會(huì)影響PCR產(chǎn)物的生成和質(zhì)量.ISSR標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出 100多條通用引物,但不是每條引物都適合于所有物種,因此,運(yùn)用該標(biāo)記時(shí)對(duì)引物的篩選也是非常必要的.本研究結(jié)果顯示:不同的 ISSR引物對(duì)不同的酵母菌種間的區(qū)分度有所不同.在利用該標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分類鑒定及親緣關(guān)系研究時(shí),應(yīng)盡量選用多種引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),在綜合大量譜帶信息的基礎(chǔ)上再進(jìn)行聚類分析.

本研究利用 ISSR分子標(biāo)記獲得的多態(tài)性條帶,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的 19株酵母菌可在一定程度上進(jìn)行區(qū)分,比較適合于酵母菌的種間鑒別.因此,ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于酵母菌菌種鑒別是可行的,可以作為酵母菌分類鑒定的輔助手段.要將這 19株酵母菌準(zhǔn)確鑒定到種的水平,還需結(jié)合其他輔助手段,如 26 S rDNA D1/D2區(qū)序列分析和 5.8 S r DNA-ITS區(qū)域的 PCR-RFLP分析等,每種技術(shù)手段都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),多種技術(shù)手段的結(jié)合才能大大提高酵母菌種鑒定的準(zhǔn)確性.

圖 6 19株酵母菌 ISSR聚類分析樹形圖

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