黃勇蝦 賴躍坤 林龍翔 孫 嵐 林昌健

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,福建廈門 361005)

微圖案化鈣磷鹽膜層的電化學(xué)構(gòu)筑及其生物性能

黃勇蝦 賴躍坤 林龍翔 孫 嵐*林昌健*

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,福建廈門 361005)

基于表面分子自組裝和光催化轉(zhuǎn)印技術(shù),在TiO2膜層表面獲得超親/超疏水陣列微圖案模板,結(jié)合電化學(xué)沉積技術(shù),成功制備了微圖案化鈣磷鹽膜(CaP)層.掃描電子顯微鏡(SEM)和電子探針分析(EPMA)結(jié)果表明,通過超親/超疏水陣列微圖案模板可構(gòu)筑高空間分辨的微圖案化鈣磷鹽膜層.微圖案化鈣磷鹽膜層的體外MG-63細(xì)胞培養(yǎng)證實,細(xì)胞對鈣磷鹽膜層微單元有強(qiáng)烈的選擇性粘附作用,從而可望控制細(xì)胞在微單元中的貼壁生長,實現(xiàn)高通量評價細(xì)胞行為.

TiO2;超親/超疏水;鈣磷鹽膜層;微圖案;生物性能

細(xì)胞與生物材料的相互作用是一個非常重要的研究領(lǐng)域[1],而如何有效地引導(dǎo)和控制細(xì)胞在材料表面的粘附行為是一個關(guān)鍵性的問題[2-5].早在1912年,“接觸引導(dǎo)”現(xiàn)象研究的先驅(qū)Harrison[6]通過實驗證實細(xì)胞可沿蜘蛛絲方向生長,第一次報道了材料拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響,推動了蛋白質(zhì)和細(xì)胞圖案化研究領(lǐng)域的問世.近年來,各種物理、化學(xué)、生物等新的表面圖案化技術(shù)不斷涌現(xiàn),如軟光刻[7-8]、電紡絲[9]、激光掃描[10-12]、電子束刻蝕[13]、熱模壓印技術(shù)[14]等.研究者們通過多種方法在不同材料表面制作出尺寸各異的圖案,并利用此類圖案引導(dǎo)和控制成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的響應(yīng),包括細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖、分化及遷移等一系列事件[15-16].

具有浸潤性差異的超親/超疏水性膜層圖案化技術(shù)受到了人們廣泛的關(guān)注.研究發(fā)現(xiàn),如能在同一材料表面集成大量不同潤濕性的單元,有可能獲得更加誘人的特性.所謂超親水表面是指與水接觸角小于5°的表面,而超疏水表面是指與水的接觸角大于150°的表面.從超親水到超疏水的梯度表面集成可賦予表面更大的取向驅(qū)動力,驅(qū)動液體移動沉積,這無疑是對固-液浸潤性研究和應(yīng)用的進(jìn)一步拓展,對科學(xué)研究和實際應(yīng)用均有潛在的重要意義.如Tadanaga等[17]利用溶膠凝膠法和水熱法在玻璃片表面制備花簇狀的Al2O3,提拉覆蓋TiO2膜層后,結(jié)合自組裝方法和TiO2的光催化特性,制備了超親/超疏圖案;Fujishima等[18]用陰極電沉積法制備ZnO納米柱,并利用選擇性區(qū)域光照獲得超親/超疏圖案; Lin課題組[19-22]通過單分子自組裝和光催化轉(zhuǎn)印技術(shù),在鈦表面獲得了超親/超疏水陣列微圖案.

本研究基于表面分子自組裝和光催化轉(zhuǎn)印技術(shù),在TiO2膜層表面獲得超親/超疏水陣列微圖案模板,結(jié)合電化學(xué)沉積技術(shù),在TiO2膜層表面構(gòu)筑鈣磷鹽膜層微圖案,并應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)和電子探針分析(EPMA)對鈣磷鹽膜層微圖案進(jìn)行分析和表征.通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗,考察鈣磷鹽膜層微圖案的生物性能,探究成骨細(xì)胞在鈣磷鹽膜層微圖案上的粘附取向.

1 實驗部分

1.1 試 劑

氫氟酸(HF)、氟硅烷(PTES)、硝酸鈣(CaNO3· 4H2O)、磷酸二氫銨(NH4H2PO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4· 2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)為分析純,均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗貯存液、胰酶消化液為生物試劑,均購于鷺隆生物科技發(fā)展有限公司.

1.2 鈣磷鹽膜層微圖案的電化學(xué)構(gòu)筑與表征

應(yīng)用電化學(xué)陽極氧化[23]的方法在純鈦表面構(gòu)筑一層TiO2納米管陣列膜,然后將其在1%(w)的PTES-甲醇溶液中浸泡1 h,并于140℃烘烤1 h,獲得表面均勻的超疏水TiO2納米管陣列膜層.將光掩模貼覆在超疏水TiO2納米管表面,紫外光照射1 h,得到形狀和尺寸與光掩模一致的超親/疏水圖案[19].將超親/超疏水陣列模板浸入含 0.042 mol·L-1Ca(NO3)2和0.025 mol·L-1NH4H2PO4的電解液中,在0.5 mA·cm-2的電流密度下電沉積一定時間[24],獲得鈣磷鹽膜層微圖案.應(yīng)用日本Hitachi公司生產(chǎn)的S4800掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微圖案膜層的表面形貌.用日本Jeol公司生產(chǎn)的JXA-8100電子探針分析(EPMA)儀探測微圖案表面的元素分布.

1.3 體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗

MG-63細(xì)胞是一種成骨樣細(xì)胞,常被用來評價仿生骨膜層的生物相容性.本工作采用MG-63細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗.將樣品置于24孔培養(yǎng)板中,在孔中加入一定量的細(xì)胞懸液,補(bǔ)充培養(yǎng)基,培養(yǎng)一定時間后取出,經(jīng)固定、脫水、冷凍干燥、噴金等處理后,用日本Jeol公司生產(chǎn)的JSM6390掃描電子顯微鏡觀測材料表面的細(xì)胞生長狀態(tài).

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣磷鹽膜層微圖案的表征

電沉積制備鈣磷鹽膜層是通過控制電化學(xué)反應(yīng),調(diào)節(jié)陰極/溶液界面化學(xué)環(huán)境,使電解液中的鈣磷物種在陰極表面相對高的pH環(huán)境下達(dá)到一定過飽和,進(jìn)而從溶液相中結(jié)晶析出,沉積在金屬電極表面.圖1為超親/超疏水模板表面電沉積1 min得到的不同放大倍數(shù)下鈣磷鹽膜層微圖案的SEM圖.從圖中可以看出,正方形的超親水區(qū)域選擇性地生長了一層鈣磷鹽膜層,而在修飾有氟硅烷的超疏水區(qū)域則沒有鈣磷鹽膜層.這表明鈣磷鹽晶體只在超親/疏水圖案模板特定的微單元區(qū)域選擇性沉積,從而獲得了納-微米有序結(jié)構(gòu)的鈣磷鹽生物材料微圖案.鈣磷鹽膜層只在超親水區(qū)域沉積原因是:將超親/超疏水陣列模板浸入溶液后,超疏水區(qū)域的固/液界面會產(chǎn)成一層空氣阻擋膜(Cassie model),使得電解液只能在超親水區(qū)域鋪展,因而鈣磷鹽膜層僅選擇性地在超親水區(qū)域沉積,而不在超疏水區(qū)域沉積.

圖2(a,b)分別為鈣磷鹽膜層微圖案中Ca、P兩種元素的面掃描EPMA圖.右邊的標(biāo)尺中,綠色和藍(lán)色代表元素濃度較高的區(qū)域,黑色代表元素濃度為零的區(qū)域.由于鈣磷鹽選擇性地優(yōu)先在超親水區(qū)域內(nèi)沉積,導(dǎo)致Ca、P兩種元素富集于正方形的超親水區(qū)域,而超疏水區(qū)域的元素濃度則為零,從而得到了與模板的形狀和尺寸相一致的元素濃度分布圖,這與SEM的結(jié)果是一致的.

圖1 電化學(xué)沉積1 min得到的鈣磷鹽膜層微圖案不同放大倍數(shù)下的SEM圖Fig.1 SEM images of the patterned CaP films obtained by electrochemical deposition for 1 min with various magnifications

圖2 電化學(xué)沉積1 min得到的鈣磷鹽膜層微圖案的EPMA圖Fig.2 EPMA of the patterned CaP films by electrochemical deposition for 1 min(a)Ca,(b)P;The scale on the right side corresponds to element concentration which decreases from the top to bottom.The first and second data list are signal intensity and area percentage of element,respectively.

2.2 生物性能測試

為了考察細(xì)胞在制得的鈣磷鹽膜層微圖案上的粘附取向,采用體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗,將MG-63成骨細(xì)胞以1×10-5cm-2的密度種植于膜層表面,孵化6 h后取出進(jìn)行冷凍干燥處理,用SEM觀察成骨細(xì)胞在圖案表面的粘附狀態(tài).圖3(a-c)分別為電沉積1、3和5 min所得到的鈣磷鹽膜層微圖案經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗后表面細(xì)胞微圖案的SEM圖,圖3d為圖3c的局部放大圖.可以看出,細(xì)胞選擇性地優(yōu)先在有鈣磷鹽膜層的微單元表面粘附,而疏水區(qū)域未見有細(xì)胞粘附.由此可見,細(xì)胞只趨于在有高生物活性的鈣磷鹽膜層單元粘附生長.此外,比較不同沉積時間制備的鈣磷鹽陣列微圖案膜層上的細(xì)胞數(shù)量可以看出,由于電沉積1和3 min得到的微圖案化鈣磷鹽(圖3a和3b)不足,其表面的細(xì)胞粘附數(shù)量很少,而電沉積5 min得到的微圖案化鈣磷鹽膜層單元(圖3c)中細(xì)胞的粘附明顯密集.對細(xì)胞的粘附狀態(tài)的進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),在不同沉積時間所制得的微圖案膜層表面,細(xì)胞的生長狀態(tài)也有明顯差異.從圖3d可以看出,電沉積5 min所得的樣品表面細(xì)胞生長的比較舒展,可明顯看到細(xì)胞的觸須,這表明隨著電沉積時間的延長,鈣磷鹽膜層的致密性逐漸增加,膜層的生物相容性提高,細(xì)胞的粘附和生長狀態(tài)更好.

圖3 在不同電沉積時間的鈣磷鹽微圖案表面培養(yǎng)MG-63細(xì)胞6 h后的SEM圖Fig.3 SEM images of MG-63 cells cultured on the patterned CaP films for 6 h with different deposition timedeposition time:(a)1 min,(b)3 min,(c)5 min;(d)higher magnification of(c)

3 結(jié)論

利用具有浸潤性差異的陣列微圖案模板,結(jié)合電化學(xué)沉積技術(shù),在TiO2表面構(gòu)筑了具有微-納米結(jié)構(gòu)的鈣磷鹽膜層微圖案.分析表明,超親/疏水圖案模板能夠誘導(dǎo)鈣磷鹽晶體在特定的區(qū)域選擇性沉積.體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明,細(xì)胞強(qiáng)烈地趨于在鈣磷鹽膜層微單元中粘附,且電沉積時間越長,得到的鈣磷鹽膜層越致密,其生物相容性越好,成骨細(xì)胞的生長狀態(tài)越好,從而有望實現(xiàn)細(xì)胞定向生長的可控及高通量評價細(xì)胞行為.

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23 Lai,Y.K.;Sun,L.;Zuo,J.;Lin,C.J.Acta Phys.-Chim.Sin.,2004, 20:1063 [賴躍坤,孫 嵐,左 娟,林昌健.物理化學(xué)學(xué)報, 2004,20:1063]

24 Wang,H.;Lin,C.J.;Zhao,D.M.;Hu,R.;Zhang,F.;Lin,L.W. J.Biomed.Mater.Res.Part A,2008,87:698

March 29,2010;Revised:May 20,2010;Published on Web:June 30,2010.

Electrochemical Construction and Biological Performance of Micropatterned CaP Films

HUANG Yong-Xia LAI Yue-Kun LIN Long-Xiang SUN Lan*LIN Chang-Jian*
(Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005, Fujian Province,P.R.China)

Based on surface molecule self-assembly and photocatalytic lithography techniques,superhydrophilic/ superhydrophobic micropatterns were fabricated on TiO2films.Micropatterned calcium phosphate(CaP)films were successfully fabricated by theas-prepared superhydrophilic/superhydrophobictemplatecombined with the electrochemical deposition method.Scanning electron microscopy (SEM)and electron probe microanalysis(EPMA) indicated that micropatterned CaP films with a high spatial resolution could be constructed using the superhydrophilic/ superhydrophobic micropatterns as templates.In vitro MG-63 cell tests of the micropatterned CaP films showed that the cells selectively adhered to the tiny CaP film units,which is promising for the control of the adherent growth of the cells on the tiny units and to achieve a high throughput evaluation of the cell behavior.

Titania;Superhydrophilic/superhydrophobic;CaP film;Micropattern; Biological performance

[Communication] www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding authors.Email:sunlan@xmu.edu.cn,cjlin@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2184655.

The project was supported by the Major International Collaborative Research Projects of the National Natural Science Foundation of China (20620130427),National Natural Science Foundation of China(20773100),National Key Basic Research Program of China(973)(2007CB935603) and International Scientific and Technological Cooperation Projects of the Ministry of Science and Technology of China(2007DFC40440).

國家自然科學(xué)基金-重大國際合作研究項目(20620130427),國家自然科學(xué)基金項目(20773100),國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(973) (2007CB935603)和國家科技部國際合作重大項目(2007DFC40440)資助

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