巨云為，樊培峰，奚月明，薛中官

（1.南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037；3.江蘇省南京市農(nóng)林局，江蘇 南京 210008；4.江蘇省連云港市林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇連云港 222001）

松材線蟲(chóng)病Bursaphelenchus xylophilus是松樹(shù)的一種毀滅性病害。該病自發(fā)現(xiàn)以來(lái)已經(jīng)迅速在中國(guó)絕大多數(shù)松林地區(qū)爆發(fā)，至今還沒(méi)有有效的防治方法，目前仍然以藥劑防治為主，但效果較差，且污染環(huán)境［1］。隨著人類(lèi)文明程度的不斷提高，人們的環(huán)保意識(shí)及對(duì)自身生活質(zhì)量的要求也不斷提高，因此，使用高效低毒的藥劑來(lái)防治線蟲(chóng)，特別是在蔬菜、茶葉、中草藥、花卉及園林植物上的應(yīng)用尤其顯得迫切。“生物合理性”農(nóng)藥的研制已成為當(dāng)今農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，從植物的次生代謝物中尋找具有殺蟲(chóng)活性的物質(zhì)，以獲得研制新型、環(huán)保、和諧殺蟲(chóng)劑的模板化合物就是重要的途徑之一［2－6］。菊科Compositae植物是被子植物中最大的科，廣布全球，其中中國(guó)有240屬，特有29屬，占中國(guó)菊科野生屬總數(shù)的13.43%。菊科植物化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性均居植物界之首，潛在著大量的殺菌、殺蟲(chóng)活性成分，具有極高的研究?jī)r(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景［7］。本研究通過(guò)測(cè)定萬(wàn)壽菊Tagetes erecta粗提物殺松材線蟲(chóng)活性，從而為菊科植物源殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)與利用提供一定的依據(jù)，同時(shí)也為直接利用植物材料配制應(yīng)用農(nóng)藥提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 松材線蟲(chóng) 松材線蟲(chóng)取自南京地區(qū)病死的馬尾松Pinus massoniana。用貝曼氏漏斗法分離病樹(shù)上的松材線蟲(chóng)，在顯微鏡下經(jīng)人工挑取純化，接種在嚴(yán)格滅菌的長(zhǎng)滿灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約7 d后分離培養(yǎng)皿中的松材線蟲(chóng)，用無(wú)菌水配制成含松材線蟲(chóng)約100條·滴－1的松材線蟲(chóng)懸濁液，備用。

1.1.2 供試材料 萬(wàn)壽菊的花、莖和根等3個(gè)部分。

1.2 粗提物的制備

1.2.1 材料的處理方法 將收集得到的萬(wàn)壽菊材料分成根、莖和花等3個(gè)部分，然后將這3部分分別洗凈，放在干燥箱中，在50℃的溫度下進(jìn)行干燥處理。干燥完成后，將它們分別用Jw6312型粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉末狀。

1.2.2 粗提物的提取方法 取萬(wàn)壽菊根、莖和花的粉碎物各100 g，分別將它們放在體積分?jǐn)?shù)為99%的乙醇中室溫下進(jìn)行浸泡處理，2 d更換1次乙醇浸液。先用400目網(wǎng)篩過(guò)濾1次浸液，然后再對(duì)過(guò)濾的浸液進(jìn)行抽慮過(guò)濾。連續(xù)浸泡提取3次后合并提取液。最后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進(jìn)行減壓蒸發(fā)，得到3種黏稠狀（膠狀）粗提物。將得到的膠狀粗提物密封，放4℃冰箱中備用。

1.3 生測(cè)方法

1.3.1 藥液的配制 用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取各種粗提物適量，用無(wú)菌水進(jìn)行溶解，將各種粗提物分別配制成 1.000，0.500，0.100，0.050，0.010，0.001 g·L－1共 6個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，備用。

1.3.2 浸泡生測(cè)法 取若干直徑2 cm的小玻璃培養(yǎng)皿，然后把各種藥液按不同質(zhì)量濃度取3 mL放入小培養(yǎng)皿中，各種提取物做4組平行組，用清水做為對(duì)照組。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入大約100條松材線蟲(chóng)，放在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h觀察記錄1次松材線蟲(chóng)的死亡率，72 h后結(jié)束觀察［8］。

2 結(jié)果

2.1 提取物的粗提結(jié)果

稱(chēng)量蒸發(fā)濃縮所得各粗提物質(zhì)量，計(jì)算粗提物得率。粗提物得率 =［濃縮所得粗提物質(zhì)量/取用的材料的質(zhì)量（100 g）］× 100%。

所得萬(wàn)壽菊莖的乙醇粗提物為10 g，粗提物得率為10%。所得萬(wàn)壽菊根的乙醇粗提物為8 g，粗提物得率為8%。所得萬(wàn)壽菊花的乙醇粗提物為6 g，粗提物得率為6%。

2.2 粗提物的殺線活性測(cè)定結(jié)果

觀察并統(tǒng)計(jì)不同質(zhì)量濃度的各種粗提物藥液對(duì)松材線蟲(chóng)的致死率，并采用直線回歸法計(jì)算毒力回歸方程以及半致死濃度C50。

2.2.1 萬(wàn)壽菊各部分粗提物的殺松材線蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2.2 萬(wàn)壽菊各部分粗提物的最終生測(cè)結(jié)果分析測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從以上圖1和表1，我們可以看出，萬(wàn)壽菊的根、莖和花的粗提物對(duì)松材線蟲(chóng)的毒殺效果都比較明顯，并且從圖中可以看出松材線蟲(chóng)的致死率隨著粗提物藥液質(zhì)量濃度的增加也有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中萬(wàn)壽菊根粗提物的殺松材線蟲(chóng)活性最為顯著，0.1 g·L－1以上質(zhì)量濃度時(shí)，72 h內(nèi)的線蟲(chóng)致死率在 90%以上，其半致死質(zhì)量濃度C50達(dá)到 0.006 3 g·L－1。

表1 萬(wàn)壽菊各部分粗提物的生測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分析Table 1 Data analysis about toxicity of marigold extracts against Bursaphelenchus xylophilus

圖1 不同質(zhì)量濃度萬(wàn)壽菊各部分粗提物對(duì)松材線蟲(chóng)作用Figure 1 Toxicity of marigold root against the nematode

3 結(jié)論與討論

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)壽菊的根、莖和花各部分的粗提物對(duì)松材線蟲(chóng)都具有一定的毒性，其中根的粗提物最為顯著。隨著粗提物藥液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)松材線蟲(chóng)的毒性也有增加的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度的時(shí)候就可以全部殺死松材線蟲(chóng)。并且發(fā)現(xiàn)，粗提物藥液對(duì)松材線蟲(chóng)的抑制作用有隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)合前人的研究和本次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明了萬(wàn)壽菊粗提物具有較強(qiáng)的殺松材線蟲(chóng)活性，在防治松材線蟲(chóng)病方面具有良好的應(yīng)用前景。

本次實(shí)驗(yàn)只是對(duì)萬(wàn)壽菊的根、莖和花的粗提物單一的進(jìn)行了對(duì)松材線蟲(chóng)毒性的測(cè)試，并沒(méi)有進(jìn)行它們之間的混配實(shí)驗(yàn)，而且并沒(méi)有對(duì)其粗提取物中所含的有效成分的進(jìn)一步分離和鑒定，這些將是我們下一步研究的方向和重點(diǎn)。

萬(wàn)壽菊具有同印楝Azadirachta indica，川楝Melia toosendan，煙草Nicotiana tabacum和魚(yú)藤Derris trifoliata等同樣的地位，成為從2 400種已記載控害植物中挑選出來(lái)的43種廣譜控害植物之一，被譽(yù)為 “控害的精華”［8－9］。萬(wàn)壽菊化學(xué)成分包括噻吩類(lèi)、精油、色素、黃酮及苷類(lèi)等。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊的提取物對(duì)多種線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)有毒殺作用，并且對(duì)多種植物病原菌有明顯的抑制作用［10－11］。Zechmeister和Sease首次從萬(wàn)壽菊花中分離出三聚噻吩和它的衍生物，并有人發(fā)現(xiàn)在紫外光（320～400 nm）照射下，噻吩類(lèi)化合物對(duì)線蟲(chóng)有生物活性。Uhlenbroek等測(cè)試了從萬(wàn)壽菊根中分出的噻吩及合成噻吩對(duì)3種線蟲(chóng)的活性，結(jié)果顯示萬(wàn)壽菊中的殺線蟲(chóng)活性成分是噻吩物質(zhì)。樂(lè)海洋在從萬(wàn)壽菊中分離殺蟲(chóng)物質(zhì)，進(jìn)行光活化基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)生長(zhǎng)的萬(wàn)壽菊所含的殺蟲(chóng)有效成分比國(guó)外的要高［11-13］，因此，中國(guó)的萬(wàn)壽菊在生物農(nóng)藥研究方面有更好的研究?jī)r(jià)值。

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