柯艷蓉 金宏威 劉振明 張亮仁

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

A1腺苷受體的同源模建及其結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

柯艷蓉 金宏威 劉振明 張亮仁*

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

采用同源模建的方法構(gòu)建了A1腺苷受體的三維結(jié)構(gòu),并與拮抗劑分子DPCPX對(duì)接,將得到的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,以最后2 ns的平均結(jié)構(gòu)和平衡后抽取的11幀構(gòu)象共12個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)為研究對(duì)象,用包含52個(gè)活性分子和1000個(gè)誘餌分子的測(cè)試庫,分別通過DOCK、VINA和GOLD三種對(duì)接軟件進(jìn)行評(píng)價(jià),最終得出合理的蛋白質(zhì)模型.根據(jù)top10%的富集因子(EF)和ROC曲線下面積(AU-ROC)的計(jì)算結(jié)果,我們認(rèn)為GOLD是最適合A1腺苷受體的對(duì)接軟件,而12個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中F5和Favg的三維結(jié)構(gòu)模型比較合理,可以作為進(jìn)一步大規(guī)模虛擬篩選的模型.

分子動(dòng)力學(xué)模擬;A1腺苷受體; 同源模建;GOLD; 虛擬篩選

腺苷受體是G蛋白偶合受體(GPCR)蛋白受體家族成員,其主要結(jié)構(gòu)特征包括了七次跨膜的疏水螺旋區(qū)(transmembrane,TM1-TM7)、N端區(qū)、三個(gè)胞外LOOP區(qū)(extracellular loop,EL1-EL3)、三個(gè)胞內(nèi)LOOP區(qū)(intracellular loop,IL1-IL3)和C端區(qū).胞內(nèi)IL3和C端區(qū)與G蛋白偶聯(lián),從而影響環(huán)磷酸腺苷酶或磷酸脂酶C的活性,使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使,并通過信息傳遞,參與細(xì)胞物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控.腺苷受體有四種亞型,分別為A1、A2A、A2B、A3[1],并且通過內(nèi)源性的腺苷調(diào)節(jié)多種生理功能.腺苷受體有其獨(dú)特的藥理學(xué)特征、組織分布和偶聯(lián)蛋白,作為藥物靶標(biāo),其應(yīng)用領(lǐng)域相當(dāng)廣泛,主要可應(yīng)用于局部缺血性疾病(大腦和心臟)、睡眠功能障礙、免疫功能和炎癥功能紊亂、癌癥等的治療.目前,已經(jīng)設(shè)計(jì)合成出一系列的腺苷受體激動(dòng)劑和拮抗劑,并且有部分化合物已進(jìn)入臨床研究.

A1受體主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周循環(huán)系統(tǒng),并且對(duì)機(jī)體有促進(jìn)免疫的作用.A1受體集中分布在腦和脊髓中,主要是在海馬,小腦,上丘腦,皮質(zhì)I、IV、VI中大量存在.另外,A1受體也廣泛分布于心臟,在腎臟、肺和膀胱、脂肪等組織細(xì)胞中也有表達(dá).A1受體作為潛在的藥物靶標(biāo)[2-3],吸引了很多的藥物工作者對(duì)它的研究.因?yàn)?一方面A1受體的拮抗劑主要應(yīng)用于抗高血壓藥、鉀離子保留的利尿藥、認(rèn)知功能增強(qiáng)藥、緩和阿爾茲海默綜合癥[4-5],也可用于治療癡呆、緩解焦慮[6],以及治療充血性心率衰竭患者的急性腎功能紊亂[7-8]等;另一方面,A1受體拮抗劑的發(fā)展可作為蛋白受體藥理學(xué)特征的分子探針.該受體拮抗劑分子設(shè)計(jì)主要以天然的咖啡因、茶堿為母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾,主要有兩種類型:黃嘌呤結(jié)構(gòu)衍生物和非黃嘌呤結(jié)構(gòu)衍生物(多聚雜環(huán)衍生物).目前,A1受體的晶體結(jié)構(gòu)尚未解析出來,所以通常采用同源模建的方法構(gòu)建該受體的模型.目前,已報(bào)道A1受體的模型,主要是以牛視紫紅質(zhì)受體為模板[9-11].2007年,β2-腎上腺素受體晶體結(jié)構(gòu)被解析出來后[12],Yuzlenko等[13]分別以牛視紫紅質(zhì)受體和β2-腎上腺素受體為模板進(jìn)行A1受體的同源模建,發(fā)現(xiàn)β2-腎上腺素受體更適合于腺苷受體的建模.2008年,Jaakola等[14]解析了A2A受體的晶體結(jié)構(gòu),給腺苷受體家族其他亞型受體的模建提供了更好的模板.

本文通過同源模建的方法模擬了A1受體的三維結(jié)構(gòu),將得到的模型與DPCPX拮抗劑進(jìn)行分子對(duì)接,得到受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu).將該復(fù)合物置于磷脂雙分子層中進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,使受體模型結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化.將包含52個(gè)A1受體拮抗劑的測(cè)試庫分別與動(dòng)力學(xué)平衡過程中抽取的11個(gè)構(gòu)象和平均結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接,以活性分子的top10%的富集因子(enrichment factor,EF)和ROC曲線下面積(AU-ROC)大小作為結(jié)果的評(píng)價(jià)依據(jù),以便為進(jìn)行大規(guī)模虛擬篩選提供合理的受體結(jié)構(gòu).

1 計(jì)算方法

A2A受體(分辨率0.26 nm,PDB編號(hào)3EML)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來源于PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫[15].A1受體的氨基酸序列來源于SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(登記號(hào)為P30542)[16].所有蛋白模建、模型優(yōu)化、分子對(duì)接、動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算均在DELL PowerEdge 2950(Xeon E5410-2.33G×2,內(nèi)存8.0G)計(jì)算機(jī)工作站完成,所用程序?yàn)镾ybyl 6.9(Tripos公司)和Discovery Studio (DS)2.1(Accelrys公司)分子設(shè)計(jì)軟件包[17-18],計(jì)算中選用的各項(xiàng)參數(shù)除特別說明外均使用缺省值.

1.1 同源模建

A1受體由326個(gè)氨基酸殘基組成.序列比對(duì)采用DS 2.1中的Align123程序,并根據(jù)A型G蛋白偶聯(lián)受體家族中高度保守的氨基酸殘基位置對(duì)結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整.采用DS 2.1中的MODELER程序?qū)1受體模型進(jìn)行搭建,使用BLOSUM矩陣,多序列斷點(diǎn)罰分(gap open penalty)為5.0,多序列斷點(diǎn)伸展罰分(gap extension penalty)為0.05.由程序自動(dòng)生成10個(gè)模型,選取概率密度函數(shù)(probability density functions,PDF)對(duì)蛋白質(zhì)幾何性質(zhì)打分最高的模型,用Procheck程序進(jìn)行合理性評(píng)價(jià).

1.2 分子對(duì)接

首先使用SYBYL 6.9軟件對(duì)小分子和蛋白進(jìn)行處理.A1受體拮抗劑DPCPX分子的初始結(jié)構(gòu)使用sketch模塊構(gòu)建,如圖1所示,并對(duì)小分子加氫和加Gasteige-Hückel電荷.對(duì)所構(gòu)建的初始結(jié)構(gòu)依次進(jìn)行1000步最陡下降法和1000步共軛梯度法優(yōu)化.使用Biopolymer模塊對(duì)蛋白模型加極性氫和賦予AMBER7 FF99電荷.分子對(duì)接使用GOLD 3.0.1程序[19],將DPCPX分子置入受體的活性位點(diǎn).我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的突變數(shù)據(jù)[20-21]來定義A1受體的活性位點(diǎn),即以Ser94和His278兩個(gè)關(guān)鍵殘基的中心坐標(biāo)為中心,半徑為2.5 nm的球形空間為活性口袋.該口袋包含的關(guān)鍵殘基有Leu88、Thr91、Gln92、Ser94、His251和His278[22].采用遺傳算法(GA)進(jìn)行蛋白-配體對(duì)接,對(duì)接時(shí)考慮配體柔性和蛋白部分柔性.采用Goldscore打分函數(shù),選擇打分值最高的小分子結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究.

圖1 DPCPX化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of DPCPX

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

對(duì)于DPCPX分子使用Gaussian 03程序[23],用HF方法,在6-31G*基組水平下計(jì)算該分子的靜電勢(shì).然后用AMBER 8.0軟件包中的Antechamber程序,用RESP方法計(jì)算DPCPX的部分原子電荷[24],得到小分子力場(chǎng)文件.MD模擬使用Gromacs 3.2.1程序包[25-26],用‘genbox’命令將對(duì)接得到的復(fù)合物置入DPPC256膜中.膜中心56個(gè)磷脂分子被自動(dòng)刪除避免與蛋白產(chǎn)生碰撞.然后,對(duì)整個(gè)體系添加SPC水模型,添加13個(gè)氯離子,使體系保持電中性.模擬體系共有58147個(gè)原子,其中3078個(gè)蛋白質(zhì)原子,200個(gè)磷脂膜分子,15011個(gè)水分子,13個(gè)氯離子.

采用Gromacs 96[27]力場(chǎng),將蛋白質(zhì)復(fù)合物-膜-水體系分別用最陡下降法和共軛梯度各進(jìn)行1000步的能量?jī)?yōu)化,以避免模擬時(shí)原子間的不合理碰撞;然后,束縛蛋白和小分子,對(duì)膜-水體系進(jìn)行200 ps的動(dòng)力學(xué)模擬;再束縛蛋白主鏈和小分子,對(duì)蛋白側(cè)鏈-膜-水體系進(jìn)行200 ps的動(dòng)力學(xué)模擬;最后對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行5 ns的恒溫恒壓分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算.動(dòng)力學(xué)過程中,步長(zhǎng)設(shè)為2 fs;使用Berendsen等[28]提出的溫度和壓力耦合方法,使系統(tǒng)溫度保持在310 K,耦合時(shí)間0.1 ps;壓力保持在105 Pa,采用0.5 ps耦合時(shí)間模擬自由水.模擬水分子的等溫壓縮系數(shù)設(shè)為 4.5×10-10Pa-1,用 LINCS(linear constraint)算法[29]約束所有原子的鍵長(zhǎng),計(jì)算距離小于1 nm的帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用;用PME(particle-mesh Ewald)方法[30]計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用,格點(diǎn)寬度設(shè)為0.12 nm;Lennard-Jones相互作用的截?cái)嗑嚯x設(shè)為1 nm.

在最后2 ns模擬時(shí)間內(nèi),每隔20幀保留一個(gè)構(gòu)象,總共抽取了11個(gè)構(gòu)象,分別命名為F1－F11.再計(jì)算得到最后2 ns模擬時(shí)間內(nèi)的平均結(jié)構(gòu),并對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行真空中的800步最陡下降法和1200步的共軛梯度法的能量?jī)?yōu)化,獲得最終結(jié)構(gòu)命名為Favg.這12個(gè)DPCPX-A1受體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)將用于進(jìn)一步模型評(píng)價(jià).

1.4 小分子數(shù)據(jù)庫的制作

從MDDR(Elevier MDL,San Leandro CA)數(shù)據(jù)庫中,隨機(jī)抽取52個(gè)A1受體的拮抗劑,與來自薛定諤網(wǎng)站上的1000個(gè)分子量為400的decoys,組成一個(gè)含有1052個(gè)分子的測(cè)試庫.使用Concord v 6.1.3程序得到測(cè)試庫分子的三維結(jié)構(gòu)用于虛擬篩選評(píng)價(jià).

1.5 模型評(píng)價(jià)

虛擬篩選評(píng)價(jià)采用VINA、DOCK 4.0、GOLD 3.0.1三種對(duì)接軟件.使用DOCK 4.0軟件包[31-32]進(jìn)行對(duì)接時(shí),通過Sphgen程序?qū)Φ鞍棕?fù)像進(jìn)行聚類,以每個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的配體分子定義活性位點(diǎn),格點(diǎn)球半徑為1 nm.對(duì)接結(jié)果以能量打分進(jìn)行排序.使用VINA軟件[33]進(jìn)行對(duì)接,受體和小分子先后在MGLTools 1.4.6中打開進(jìn)行對(duì)接前文件處理,對(duì)于受體結(jié)構(gòu),添加極性氫原子,計(jì)算電荷.用小分子定義活性位點(diǎn)的中心,并界定2 nm×2 nm×2 nm的對(duì)接格點(diǎn)范圍.對(duì)接結(jié)果進(jìn)行能量排序.使用GOLD 3.0.1軟件[19]進(jìn)行對(duì)接,以配體小分子定義活性位點(diǎn),以小分子為中心半徑為2.5 nm的球形空間為活性口袋.采用遺傳算法(GA)進(jìn)行蛋白-配體對(duì)接,對(duì)接時(shí)考慮配體柔性和蛋白部分柔性.采用Goldscore打分作為打分函數(shù),以GOLD fitness function值進(jìn)行排序.

2 結(jié)果與討論

2.1 同源模型的評(píng)價(jià)

通過Align123程序的序列比對(duì)如圖2所示,結(jié)果表明A1和A2A具有較高的序列相似度(similarity:71.6%)和一致性(identity:54.1%),是以其他GPCRs蛋白晶體結(jié)構(gòu)為模板的多序列比對(duì)達(dá)不到的.而且,模建模型中保留了腺苷受體TM3和EL2二硫鍵(A1:Cys80-Cys169)的特征,且EL3中Cys260-Cys263二硫鍵特征(見圖3)與A2A晶體結(jié)構(gòu)二硫鍵特征相符[14].我們使用Procheck程序?qū)δＰ徒Y(jié)構(gòu)的立體化學(xué)參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià),該程序可以憑經(jīng)驗(yàn)比較給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與最合理的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間立體化學(xué)性質(zhì)的差異.評(píng)價(jià)結(jié)果中主要考察所有氨基酸殘基骨架的二面角分布,并通過程序生成的Ramachandran圖來表示(見圖4).我們可以看到模建的蛋白質(zhì)有93.5%的殘基落入最佳區(qū)域(the most favoured regions),5.8%的殘基落入其它許可區(qū)(additional allowed regions),0.7%的殘基落入勉強(qiáng)許可區(qū)(gener-ously allowed regions),無殘基落入不允許區(qū)(disallowed regions).上述結(jié)果說明模建得到的A1受體模型氨基酸二面角結(jié)構(gòu)是比較合理的.

2.2 受體抑制狀態(tài)模型的構(gòu)建和分子動(dòng)力學(xué)模擬

DPCPX是黃嘌呤結(jié)構(gòu)的高選擇A1受體的拮抗劑分子,該分子與A1受體的親和力 Ki值為3.9 nmol·L-1,其選擇性表現(xiàn)為該分子與其它亞型受體的親和力 Ki值分別為 A2A:129 nmol·L-1、A2B:56 nmol·L-1、A3:3980 nmol·L-1[34].而且,同位素[3H] DPCPX被廣泛應(yīng)用于A1和A2B受體放射性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和突變實(shí)驗(yàn)研究.因此,我們選擇DPCPX分子與A1模型進(jìn)行分子對(duì)接.選擇Goldscore打分最好的構(gòu)象,進(jìn)行下一步的動(dòng)力學(xué)模擬.

將A1受體-DPCPX復(fù)合物模型置于DPPC膜中進(jìn)行了5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬(圖5).在模擬過程中,DPCPX小分子拮抗劑誘導(dǎo)大分子受體構(gòu)象逐漸變化,最終達(dá)到能量平衡.相對(duì)于起始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RMSD)計(jì)算結(jié)果證明了軌跡的穩(wěn)定性.圖6給出了5 ns模擬時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)骨架和小分子的RMSD值隨時(shí)間的變化曲線.可以看到,在開始的1.5 ns模擬時(shí)間內(nèi),蛋白質(zhì)骨架的RMSD值(黑色曲線)緩慢上升達(dá)到0.25 nm,表明了蛋白分子的運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)的不斷變化.而在1.5 ns之后,RMSD值趨于穩(wěn)定,在 0.25-0.3 nm之間上下波動(dòng).小分子的RMSD值(紅色曲線)變化不大,一直穩(wěn)定在0.1 nm范圍內(nèi),處于平衡的動(dòng)力學(xué)狀態(tài).從該體系在模擬過程中的勢(shì)能變化曲線(圖7)可以看出,體系的勢(shì)能在最初的十幾ps時(shí)間內(nèi)迅速降低,然后隨著模擬的進(jìn)程勢(shì)能逐漸降低,并從3 ns開始勢(shì)能趨于穩(wěn)定直到5 ns,說明該體系已經(jīng)達(dá)到平衡.根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果,我們從3 ns起每隔20幀取一個(gè)構(gòu)象,共取得11個(gè)構(gòu)象(F1-F11).再加上3-5 ns時(shí)間內(nèi)的平均結(jié)構(gòu)(Favg),共得到12個(gè)結(jié)構(gòu).

圖5 動(dòng)力學(xué)模擬過程中DPPC256磷脂膜-A1受體-DPCPX體系的初始結(jié)構(gòu)模型Fig.5 Initial model containing DPPC256,A1 receptor,and DPCPX for the molecular dynamics simulation

圖8給出了Favg中,小分子和蛋白的結(jié)合模式.我們可以看到,DPCPX分子主要結(jié)合區(qū)域是TM2、TM3、TM6、TM7,殘基 His278、Val58、Val87和殘基 Leu90、Thr91、Ala54、Asp55分別構(gòu)成了兩個(gè)疏水性口袋,與DPCPX分子的1位和3位的丙基有疏水作用;Leu51、Leu98、Asn284和Leu239殘基也構(gòu)成了疏水性口袋,與8位的環(huán)戊烷有疏水作用.此外,DPCPX的4位羰基與Asn280和Ser281肽鍵上的氨基形成氫鍵(氫鍵鍵長(zhǎng):0.2 nm),7位氨基氮與Ser94的羥基氧具有氫鍵相互作用(氫鍵鍵長(zhǎng):0.3 nm).根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)于A1腺苷受體,突變Ser94和His278這兩個(gè)氨基酸殘基,則蛋白完全喪失與拮抗劑的結(jié)合.我們的對(duì)接結(jié)果與突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本符合[20-22].

圖6 5 ns動(dòng)力學(xué)模擬過程中蛋白質(zhì)骨架(a)和小分子拮抗劑DPCPX(b)的均方根偏差(RMSD)與時(shí)間的關(guān)系曲線Fig.6 Root mean square deviation(RMSD)vs time of the atoms from their initial positions during the 5 ns simulation of protein backbone(a)and DPCPX(b)

圖7 動(dòng)力學(xué)模擬過程中體系的勢(shì)能變化Fig.7 Total potential energy changes of the system during molecular dynamics simulation

2.3 用測(cè)試數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證模型

采用DOCK 4.0、VINA和GOLD 3.0.1對(duì)接軟件,將分子動(dòng)力學(xué)模擬得到的12個(gè)蛋白質(zhì)模型與測(cè)試庫分子進(jìn)行對(duì)接.用EF和AU-ROC兩個(gè)參數(shù)來評(píng)價(jià)蛋白模型是否合理.

EF是評(píng)價(jià)虛擬篩選好壞的一個(gè)重要指標(biāo),它是指,在選擇的排名前百分之幾(例如10%)的數(shù)據(jù)集中活性分子的濃度與初始活性分子濃度的比值.這個(gè)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)篩選中篩選出活性分子的陽性率.富集因子計(jì)算公式為[35]:

圖8 DPCPX與A1受體結(jié)合模式Fig.8 Binding profile of DPCPX and adenosine A1receptorred:the residues in TM2;blue:the residues in TM3; orange:the residues in TM5;green:the residues in TM6

其中,ligandsselected指選擇的排名前10%的分子中活性小分子的數(shù)量,Nsubset指選擇的前10%的小分子的數(shù)量,ligandstotal指整個(gè)測(cè)試庫中活性分子的總數(shù),為52,Ntotal指整個(gè)測(cè)試庫分子的總數(shù),為1052.

ROC(receiver operator characteristic)曲線描繪的是敏感度(sensitivity,Se)和特異性(specificity,Sp)的關(guān)系.AU-ROC值指的是ROC曲線下的面積[36-37].這個(gè)指標(biāo)用于測(cè)試虛擬篩選策略的優(yōu)劣,當(dāng)被評(píng)價(jià)的篩選策略都篩選出相同比例的誘餌分子時(shí),篩出活性分子的比例越高說明該策略對(duì)活性分子的敏感度越高.AU-ROC值是以具體數(shù)值表示ROC曲線下的面積,該值的區(qū)間是[0,1],1表示篩出0個(gè)誘餌分子時(shí)篩出所有的活性分子;0表示篩出全部的誘餌分子中不含有活性分子.

因此,我們希望真正有活性的化合物能夠盡可能富集在前百分之十比例(top10%)的篩選結(jié)果中,我們也希望AUC曲線下面積能越大越好,這樣有利于評(píng)價(jià)這12個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣性,選擇更合理的蛋白結(jié)構(gòu)和更合適的對(duì)接軟件用于進(jìn)一步大規(guī)模虛擬篩選研究和小分子結(jié)合模式的研究.將12個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分別通過DOCK 4.0、VINA、GOLD 3.0.1三個(gè)對(duì)接軟件分別與測(cè)試數(shù)據(jù)庫對(duì)接后,對(duì)接結(jié)果用相應(yīng)的評(píng)分函數(shù)打分并進(jìn)行排序和計(jì)算,得到相關(guān)的測(cè)試庫中52個(gè)活性分子的EF和AU-ROC值(表1).從表 1中 EF10和AU-ROC的均值,可看出DOCK、GOLD、VINA三種對(duì)接軟件中,最適合A1受體進(jìn)行虛擬篩選的對(duì)接軟件是GOLD.而且,三種對(duì)接軟件都可以特異性地選擇某些構(gòu)象的蛋白結(jié)構(gòu).對(duì)于DOCK軟件更趨向于選擇F8、F3、F4蛋白結(jié)構(gòu),VINA軟件更趨向于選擇F2、Favg、F6蛋白結(jié)構(gòu),而GOLD軟件更趨向于選擇F5、Favg、F4蛋白結(jié)構(gòu).

表1 DOCK、GOLD和VINA軟件的對(duì)接評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Evaluations of docking results obtained by DOCK,GOLD,and VINA softwares

表2 DOCK、GOLD和VINA軟件配對(duì)t檢驗(yàn)的結(jié)果Table 2 Results of DOCK,GOLD,and VINA softwares′paired samples test

分別以三個(gè)軟件中各自評(píng)價(jià)最高和評(píng)價(jià)最低的兩組蛋白模型對(duì)接計(jì)算中52個(gè)活性分子的對(duì)接能量值作為樣本數(shù)據(jù),利用SPSS軟件進(jìn)行了配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在5%顯著性水平的條件下,自由度為50的t臨界值為3.261.選擇的蛋白模型包括Favg和F8(GOLD)、F2和F1(VINA)以及F8和F2 (DOCK),分析結(jié)果見表2.可以看到,對(duì)于GOLD(t= 3.775,p＜0.001)、VINA(t=5.717,p＜0.001)和DOCK (t=8.495,p＜0.001)計(jì)算所得的t值明顯大于臨界值,說明對(duì)接中各自的兩組蛋白的小分子對(duì)接能量存在著顯著性差異,即Favg蛋白的虛擬篩選能力比F8蛋白強(qiáng)(GOLD);F1蛋白的虛擬篩選能力比F2蛋白強(qiáng)(VINA);F8蛋白的虛擬篩選能力比F2蛋白強(qiáng)(DOCK).總之,DOCK、GOLD和VINA對(duì)接軟件可以特異性地選擇某些構(gòu)象的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),并可以區(qū)分出蛋白模型的優(yōu)劣.

應(yīng)用GOLD軟件進(jìn)行虛擬篩選時(shí),F4、F5和Favg的EF10值均為4.046,說明它們是12個(gè)蛋白質(zhì)模型中比較合理的結(jié)構(gòu).此外,這三個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的曲線下面積(AU-ROC)分別為0.284、0.360、0.346,說明F5和Favg是兩個(gè)不錯(cuò)的模型,可用于進(jìn)一步的大規(guī)模虛擬篩選和小分子拮抗劑結(jié)合模式的研究.

3 結(jié) 論

用同源模建的方法對(duì)A1受體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建,經(jīng)過磷脂雙分子膜中的分子動(dòng)力學(xué)模擬,抽取了動(dòng)力學(xué)平衡中最后2 ns的11個(gè)構(gòu)象(F1-F11)和計(jì)算動(dòng)力學(xué)平衡中的平均構(gòu)象(Favg).用包含52個(gè)活性分子的測(cè)試庫分別用DOCK、VINA、GOLD三種軟件與12個(gè)模型進(jìn)行對(duì)接以驗(yàn)證模型結(jié)構(gòu),從EF10和AU-ROC平均值結(jié)果分析表明GOLD軟件是這三個(gè)軟件中最適合A1受體虛擬篩選.而且,這三種軟件都具有篩選出最優(yōu)構(gòu)象模型的能力,最優(yōu)構(gòu)象與最劣構(gòu)象的小分子對(duì)接能量存在著顯著性差異.從GOLD軟件對(duì)12個(gè)蛋白模型的選擇中,我們可知F5和Favg是最合理的蛋白結(jié)構(gòu)模型,可進(jìn)一步用于大規(guī)模虛擬篩選和小分子拮抗劑結(jié)合模式的研究.

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May 19,2010;Revised:June 7,2010;Published on Web:July 14,2010.

Homology Modeling and Structure Validation of the Adenosine A1Receptor

KE Yan-Rong JIN Hong-Wei LIU Zhen-Ming ZHANG Liang-Ren*
(State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,School of Pharmaceutical Sciences,Health Science Center, Peking University,Beijing 100191,P.R.China)

A three dimensional structure model of the adenosine A1receptor was built using homology modeling. The antagonist DPCPX was docked into the model protein to form a receptor-ligand complex.A molecular dynamics simulation over 5 ns was performed for this complex.We selected 12 protein structures,including the average structure obtained from the last 2 ns of the simulation and 11 frames extracted after equilibration for the study.A database comprising 52 active antagonists and 1000 decoys was then docked into the 12 protein models using DOCK,VINA, and GOLD software packages and these molecules were ranked by their docking scores.The best model protein with the highest enrichment factor(EF)and the largest area under the ROC(AU-ROC)was chosen for further study.The results from the enrichment factor at 10%of the ranked database(EF10)and AU-ROC calculations indicate that GOLD is the best virtual screening software for the adenosine A1receptor.GOLD docking results suggest that optimized adenosine A1receptor protein structures,Favg and F5,can be used for virtual screening and for novel design to discover more potent antagonists.

Molecular dynamics simulation;Adenosine A1receptor;Homology modeling;GOLD; Virtual screening

O641

*Corresponding author.Email:liangren@bjmu.edu.cn;Tel:+86-10-82802567.

The project was supported by the National S&T Major Project Foundation,China(2009ZX09501-002).

國家科技重大專項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)基金(2009ZX09501-002)資助項(xiàng)目