安惠霞，古力娜·達(dá)吾提，李治建，斯拉甫·艾白，

地錦草，維吾爾藥名為夏塔熱其尼(Xiahatereqini)，為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材，臨床主要用于治療手癬、體癬、足癬、花斑癬、銀屑?。?］。紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)是引起皮膚真菌的主要病原菌，占皮膚癬菌病感染的69.5%，可致手癬、足癬、頭癬等，所致癬菌病病程持久，難治愈，易復(fù)發(fā)［2］。采用透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響，高效液相色譜法研究地錦草有效部位對真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成的影響，以研究其抗真菌作用的機(jī)制。從天然藥物中有效地提取、篩選抗真菌活性部位及其成分，尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌藥物已成為一個(gè)重要的研究方向，并具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景［3-5］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 地錦草藥材由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑室提供，經(jīng)生藥學(xué)鑒定為大戟科植物地錦草Euphorbia humifusa Willd。藥材醇提取后采用大孔吸附樹脂法洗脫得到6個(gè)部位，課題組參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案》(M38-A)［6］，對6個(gè)不同部位的抗真菌敏感性進(jìn)行篩選，得出其中部位6的體外抗真菌活性最為明顯，對紅色毛癬菌的MIC達(dá)到149 mg·L-1，定位有效部位。有效部位參照中國藥典一部(附錄ⅤA)進(jìn)行含量測定，總黃酮含量為34 mg·g-1。

特比奈芬(TERB)，純度99.82%，上海誠優(yōu)有限公司提供，批號為:20090101。

1.2 試驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基 紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)，菌種編號:XYZ T.r 40013，由新疆醫(yī)科大學(xué)真菌與真菌病研究中心菌種保藏庫(XYZ)提供，均經(jīng)過常規(guī)的真菌學(xué)鑒定，在PDA培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆?。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);三氮嗎啡啉丙磺酸(MOPS，Amresco公司);

1.3 透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響 參照NCCLS推薦的M38-A方案［6］，將地錦草有效部位(實(shí)驗(yàn)濃度為64 mg·L-1)和紅色毛癬菌菌接種液分別以1∶1的比例稀釋到終濃度，26℃孵育7 d后，PBS漂洗，體積分?jǐn)?shù)為3的戊二醛固定，體積分?jǐn)?shù)為1的鋨酸固定，系列濃度乙醇脫水，丙酮+乙醇脫水，包埋劑包埋，烘烤聚合，超薄切片，染色，日立H-600型透射電鏡(TEM)觀察。

1.4 高效液相色譜法(HPLC)研究地錦草有效部位對紅色毛癬菌麥角甾醇生物合成的影響 藥物干預(yù)菌絲操作同電鏡樣品的制備。挑取各孔菌絲，PBS(pH=7.4)洗滌，精密稱取各組濕菌0.1 g，置于50 ml圓底燒瓶中，加皂化劑(0.1 g·ml-1KOH的甲醇溶液)15 ml，混勻，80℃水浴皂化90 min。加石油醚(沸程30℃ ～60℃)15 ml提取3次，合并提取液置于60 ml分液漏斗中，加水15 ml洗滌，醚層于60℃水浴揮干，得未皂化脂(nonsaponifiable lipids，NSLs)［7］，未皂化脂用甲醇溶解，定容至 5 ml，0.45 μm微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法(HPLC)測定濾液中麥角甾醇含量。

HPLC色譜條件:色譜柱 Waters symmetry shieldTMRP(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，柱溫30℃;流動相:甲醇;檢測波長:282 nm;流速:1.0 ml·min-1;進(jìn)樣量:20 μl。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 麥角甾醇含量測定結(jié)果采用Student′s t-test檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察地錦草有效部位對紅色毛癬菌超微結(jié)構(gòu)的影響 未經(jīng)藥物處理的紅色毛癬菌透射電鏡下觀察，菌絲切面的細(xì)胞壁完整、厚薄均勻、質(zhì)地致密;細(xì)胞基質(zhì)均勻，密度較大，細(xì)胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)清晰可見細(xì)胞核、線粒體、脂滴等(Fig 1A)。

地錦草有效部位作用后，紅色毛癬菌的透射電鏡觀察:當(dāng)以64 mg·L-1濃度作用后，細(xì)胞壁剝脫、破裂，細(xì)胞膜皺縮、破裂，細(xì)胞外表面有明顯高電子致密顆粒聚集，細(xì)胞腫脹明顯，在細(xì)胞內(nèi)可見較多的泡狀結(jié)構(gòu)，已無完整的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)(Fig 1B)。

Fig 1 SEM results of active component of Euphorbia humifusa and TERB against Trichophyton rubrum.TEM(A，50 000 ×)results of Control Trichophyton rubrum;Active component of Euphorbia humifusa(B，64 mg·L-1，50 000 × );TEM results of active component of Euphorbia humifusa and TRBF(C，0.005 mg·L-1，35 000×)

2.2 HPLC研究地錦草有效部位對紅色毛癬菌麥角甾醇生物合成的影響

2.2.1 方法學(xué) 將麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確配制成0.93 ～29.75 mg·L-16 個(gè)濃度的溶液，進(jìn)樣 20 μl，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，回歸方程為:^Y=39004 X+2422.3，r=0.9998。精密度和穩(wěn)定性良好，麥角甾醇的平均回收率均大于93%，RSD小于3%。

2.2.2 高效液相色譜圖(Fig 2)

2.3 麥角甾醇含量測定 由Tab 1可知，不同濃度地錦草有效部位處理后，紅色毛癬菌中麥角甾醇含量與其生長對照菌相比，含量明顯降低，差異存在顯著性(P＜0.01)，并且有明顯的劑量依賴性。

Fig 2 Effect of active component of Euphorbia humifusa on ergosterol biosynthesis of Trichophyton rubrum

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs low dose group;##P＜0.01 vs middle dose group

Group Dose/mg·L-1 Ergosterol concentration in NSLs/mg·L -1 Growth control 0 34.84±0.02 Low dose 32 23.42±0.00＊＊Middle dose 64 10.04±0.02＊＊△△High dose 128 5.06±0.05＊＊△△##Positive control 0.0025 15.81±0.04＊＊

3 討論

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分［8］，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性，與膜結(jié)合酶的活性，膜的流動性，細(xì)胞活力及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?，一旦麥角甾醇缺乏，必將引起真菌?xì)胞膜功能異常，甚至發(fā)生細(xì)胞破裂［9］。麥角甾醇生物合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶是抗真菌藥物的作用靶位，對其生物合成的研究將為抗真菌藥物的篩選及其作用機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)［8，10-13］。

地錦草是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材，應(yīng)用廣泛。維吾爾醫(yī)理論認(rèn)為，地錦草具有清除異常粘液質(zhì)、膽汁液及敗血、消腫止癢之功能，維吾爾醫(yī)常用其復(fù)方百癬夏塔熱治療手癬、體癬、足癬、花斑癬、銀屑病等疾病。本課題組參照 NCCLS推薦的 M38-A方案［6］，篩選出對臨床常見的真菌具有很強(qiáng)的抗菌作用的有效部位。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，地錦草有效部位作用后真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜出現(xiàn)多處破裂，胞內(nèi)細(xì)胞器損傷嚴(yán)重;HPLC結(jié)果說明地錦草有效部位主要作用于紅色毛癬菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成通路，抑制麥角甾醇的生物合成，從而使真菌細(xì)胞膜破壞，通透性增加，內(nèi)容物外泄，發(fā)揮其抗真菌作用。本研究用中藥化學(xué)提取分離手段與藥理實(shí)驗(yàn)密切結(jié)合，方法快速、簡單，結(jié)果可靠，初步完成了地錦草有效部位的篩選，為進(jìn)一步研究其抗真菌作用機(jī)制和分離有效的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

［1］Health Department of XinJiang Uighur Autonomous Region 1993.Standard of Uighur Medicinal Material:Vol 1［S］.Urumqi:Xinjiang Technology and Health Press，99.

［2］Yu L，Zhang W，Wang L，et al.Transcriptional profiles of the response to ketoconazole and amphotericin B in Trichophyton rubrum［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(1):144-53.

［3］何淑芳，梁佳玉，方 佳，等.黃芪有效部位群對大鼠肌成纖維細(xì)胞增殖移行及胞內(nèi)Smads蛋白磷酸化的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(7):885-8.

［3］He S F，Liang J Y，F(xiàn)ang J，et al.The effects of effective fractions of astragalus(EFA)on the proliferation and migration and Smad proteins phosphorylation in rat myofibroblas［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):885-8.

［4］孫 宇，崔 燎，昊 鐵.鹽酸水提法制備丹參水溶性有效部位群及其對成骨細(xì)胞活性測定［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(3):377-81.

［4］Sun Y，Cui L，Hao T.Preparation of Salvia miltiorrhiza utility aqueous extract by hydrochloric acid method and evaluation on osteoblast［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):377-81.

［5］史 紅，程麗艷，陶 亮.中藥復(fù)方有效部位群研究現(xiàn)狀［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(2):156-9.

［5］Shi H，Cheng L Y，Tao L.Recent development on effective fractions of compounded prescription of Chinese crude drug［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(2):156-9.

［6］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi;Approved Standard(M38-A)［P］.USA，2002.

［7］Gensser M O，Graca M A S，Balocher F.Methods to study litter decomposition:a practical guide［M］.Printed in The Netherlands，2005:189-96.

［8］Mysiakina I S，F(xiàn)untikova N S.The role of sterols in morphogenetic processes and dimorphism in fungi［J］.Mikrobiologiia，2007，76(1):5-18.

［9］Maertens J A.History of the development of azole derivatives［J］.Clin Microbiol Infect，2004，10(suppl 1):1-10.

［10］Georgopapadakon N H，Walsh T J.Human mycoses:drugs and targets for emerging pathogens［J］.Science，1994，264:371-3.

［11］Bammert G F，F(xiàn)ostel J M.Genome-wide expression patterns in Saccharomyces cerevisiae:comparison of drug treatments and genetic alterations affecting biosynthesis of ergosterol［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44(5):1255-65.

［12］陳雙紅，盛春泉，徐曉輝，等.CYP51靶酶氨基酸殘基Yl18、S378與新型唑類藥物作用機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(9):1188-92.

［12］Chen S H，Sheng C Q，Xu X H，et al.The research on the key amino acids Yll8，S378 responsible for candida albicans sterol 14αdemethylase selective interaction with new azoles analogous［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1188-92.

［13］韓 華，易楊華，喇明平，等.糙海參皂苷Scabraside A、B的抗真菌和抗腫瘤活性［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(8):1111-2.

［13］Han H，Yi Y H，La M P，et al.Studies on antifungal and antitumor aetivities of scabraside A、B from Holothuria scabra Jaeger［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1111-2.