劉雪梅，韋燕飛，彭 岳，謝海源，方 卓，段雪琳，趙鐵建

近年來研究證實，白花丹(Plumbago zeylanica L.)具有控制和逆轉(zhuǎn)乙型肝炎，肝硬化，以及控制某些晚期惡性腫瘤等方面的作用［1］，白花丹以及白花丹醌對EMT-6乳腺癌和S180肉瘤有一定的抑制作用［2］。前期動物實驗結(jié)果表明［3］，白花丹對化學性肝損害動物模型有一定的保護作用，并能抑制HSC增殖。白花丹醌是植物白花丹的主要活性成分，具有很強的活血化瘀作用，據(jù)測定白花丹根中的白花丹醌的含量多少與其活血化瘀功效的強弱相一致，此外白花丹醌具有抗腫瘤、抗炎、抗細菌、抗真菌等多種作用。本實驗以人肝星狀細胞株(HSC-LX2)為研究對象，用MTT法檢測白花丹醌對HSC-LX2增殖的影響;以 α-平滑肌動蛋白(α-SMA)作為測定HSC活化的指標，采用熒光定量PCR檢測白花丹醌對HSC-LX2α-SMA基因的表達和免疫組織化學方法檢測HSC-LX2α-SMA蛋白表達情況，探討白花丹醌抗肝纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人肝星狀細胞株(HSC-LX2)，由上海中醫(yī)藥大學肝病研究所徐列明教授饋贈。

1.2 藥物及主要試劑 白花丹醌(Sigma公司，批號:20071028);重組 leptin(protech公司，批號:8110060R);SYBR Premix Ex TaqTM，寶生物工程(大連)有限公司;DMEM(Gibico，Cat№12800-056);胎牛血清(Hyclone，批號:NTM0136);TRIzol(Invitrogen);MTT(Sigma公司，lot№3564B04);秋水仙堿(西雙版納藥業(yè)公司，批號:070205);α-SMA一抗(北京中杉生物有限公司，批號:20080323)。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo，Model 311);高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠，TGL-16G-A);相差倒置顯微鏡(德國Zeiss，XD-101型);酶標儀(美國 Thermo，Model 450);多通道 PCR儀(美國MJ公司，PTC-220);核酸蛋白測定儀(日本島津);實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司，iCycler iQ)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人肝星狀細胞株(HSC-LX2)，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，當細胞呈單層致密狀時，用0.25%胰蛋白酶消化，每3～4 d傳代一次，按1∶2傳代，每次試驗均在呈指數(shù)生長的細胞中進行。

1.4.2 細胞分組及處理 空白對照組:加入含100 ml·L-1胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液;leptin對照組:在含100 ml·L-1胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中加 leptin 1 000 μg· L-1，終濃度為 100 μg·L-1;leptin與藥物不同質(zhì)量濃度聯(lián)用組，秋水仙堿組:leptin加秋水仙堿，終濃度為6.25 mg·L-1;藥物組:在leptin刺激組基礎(chǔ)上加入白花丹醌，低、中、高劑量組終濃度分別為 2 、8 、16 μmol·L-1。

1.4.3 MTT法測定白花丹醌對細胞增殖的影響將細胞以5×107個·L-1接種于96孔板，分為leptin 對照組、白花丹醌2 、8 、16 μmol·L-1濃度組，每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后，細胞貼壁生長良好，換含各藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出全部液體，加入 200 μl DMSO，微量振蕩器上振蕩5 min，于酶標儀雙波長(570 nm，630 nm)比色，抑制率/%=(對照孔-給藥孔)/對照孔×100%。

1.4.4 熒光定量PCR法檢測α-SMA mRNA的表達 ① 將細胞以5×107個·L-1接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，每組3瓶，24 h后，細胞貼壁生長良好，換含各藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。② 采用TRIzol法抽提細胞中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度，A260/A280均在1.8～2.0之間。③ 取cDNA 5 μg，采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank查找基因序列并自行設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參，引物序列α-SMA:FP:5′-CGTGGCTACTCCTTCGTG-3′， RP:5′-TGATGACCTGCCCGTCT-3′，產(chǎn)物長度為 160 bp;β-actin:FP:5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，RP:5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，產(chǎn)物長度為153 bp。④反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s;56℃退火，20 s;72℃延伸30 s。共反應(yīng)55個循環(huán)。⑤反應(yīng)結(jié)束后分析每個反應(yīng)管內(nèi)的PCR產(chǎn)物進入指數(shù)增長期起始點所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(thrshold cycle，Ct)，以 β-actin為參照物，參考文獻［4］計算出各組mRNA相對表達情況。

1.5 免疫細胞化學法檢測HSC-LX2α-SMA的表達 將傳代培養(yǎng)的HSC-LX2用含10%胎牛血清的DMEM接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，24 h后待細胞貼壁伸展后，分組、干預(yù)同前。藥物與細胞共孵育24h后取出蓋玻片置于載玻片上，用4%多聚甲醛固定，3%H2O2過氧化氫滅活，抗原修復(fù)，血清封閉后，依次滴加α-SMA一抗、二抗試劑孵育后進行脫水、封片，鏡下觀察。采用HPIAS2000型多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)對染色陽性部位進行平均灰度值的測定。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 白花丹醌對HSC-LX2細胞增殖的影響 白花丹醌呈劑量依賴性抑制瘦素誘導(dǎo)HSC-LX2增殖，以16 μmol·L-1濃度時最為明顯，與 leptin對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of Plumbagin on proliferation of HSC-LX2±s，n=6)

Tab 1 Effects of Plumbagin on proliferation of HSC-LX2±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs leptin control group

Group OD Inhibition/%leptin control 0.914±0.089 -leptin+Plumbagin 2 μmol·L-1 0.655 ±0.072 28.4 leptin+Plumbagin 8 μmol·L-1 0.286 ±0.070＊＊ 68.7 leptin+Plumbagin 16μmol·L-1 0.046 ±0.014＊＊95.0

2.2 白花丹醌對HSC-LX2細胞α-SMA mRNA表達的影響 采用2-△△CT方法的公式進行計算，得到相對于leptin對照組α-SMA mRNA相對表達量，結(jié)果顯示:空白對照組有一定量α-SMA mRNA表達，leptin對照組leptin作用24 h，α-SMA mRNA強表達，leptin對照組與空白對照組比較差異有顯著性(P＜0.05);而經(jīng)白花丹醌和秋水仙堿作用24 h后，活化的HSC-LX2內(nèi)α-SMA mRNA含量較leptin對照組均下降(P＜0.05或P＜0.01)，以白花丹醌16、8 μmol·L-1組和秋水仙堿組尤為明顯(P ＜0.01)。見Tab 2和Fig 1～3。

Tab 2 Effects of Plumbagin on relative quantification of α-SMA mRNA expression of HSC-LX2±s，n=4)

Tab 2 Effects of Plumbagin on relative quantification of α-SMA mRNA expression of HSC-LX2±s，n=4)

▲P＜0.05 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs leptin control group

Group Relative quantification Blank control 0.709±0.166 leptin control 1.000±0.000▲leptin+colchicine 0.579±0.083＊＊leptin+Plumbagin 2 μmol·L-1 0.703 ±0.125*leptin+Plumbagin 8 μmol·L-1 0.580 ±0.092＊＊leptin+Plumbagin 16 μmol·L-1 0.487 ±0.127＊＊

Fig 1 The standard line of FQ-PCR of α-SMA positive standard

Fig 2 Amplification curve of α-SMA in flurogenic quantitative polymerase chain reaction

Fig 3 Melting curve of α-SMA in flurogenic quantitative polymerase chain reaction

2.3 白花丹醌對HSC-LX2細胞α-SMA蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果:α-SMA蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物為細胞質(zhì)棕黃色細顆粒狀染色。與空白組比較(0.09±0.01，F(xiàn)ig 4A)，leptin能明顯增強 α-SMA 蛋白的表達(0.158±0.02，F(xiàn)ig 4B)，各藥物組能抑制HSC-LX2細胞α-SMA蛋白表達，表達的面積縮小，顏色從棕黃色變?yōu)闇\黃色，低、中、高劑量組α-SMA蛋白表達水平分別為0.123±0.02、0.109±0.02、0.103±0.01(Fig 4C～E)，與leptin對照組比較差異有顯著性，P＜0.01。

Fig 4 Expression of α-SMA was detected by immunohistochemical staining in HSC-LX2 (×20)A:Blank control group;B:Leptin control group;C:Low dose group;D:Middle dose group;E:High dose group

3 討論

HSC在肝纖維化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［5］，在致病因子刺激下，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細胞，并表達 α-SMA，繼而使肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)生成增加而降解減少，最終導(dǎo)致肝臟膠原沉積與纖維化［6］。隨著肝纖維化細胞分子生物學機制的進一步明確，以HSC為靶標的治療措施逐漸成為抗肝纖維化的重要方法，如抑制HSC活化和增殖，調(diào)節(jié)膠原合成和降解等［7］。

最近研究［8］顯示，瘦素具有促進HSC活化和增殖作用，瘦素對HSC作用同血小板源性生長因子一樣是較強的有絲分裂原。研究表明［9］，在慢性肝損傷發(fā)生時，各種始發(fā)的致病因素觸發(fā)HSC活化并大量表達瘦素，其后瘦素通過自分泌和旁分泌兩條途徑作用于OB-Rb，激活其JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進肝竇內(nèi)皮細胞等表達α-SMA，并在其介導(dǎo)下進一步誘導(dǎo)HSC的增殖、活化，進而促進膠原等ECM的合成和分泌，最終促進了肝纖維化的發(fā)生。激活的HSC再大量增生、胞體增大、Vit A脂滴消失、膠原纖維等細胞外基質(zhì)分泌增多、表達更多具有收縮功能的 α-SMA。因此 α-SMA的表達已被認為是HSC激活的顯著特征之一，成為肝纖維化的一個重要的評價指標。

以往研究表明，白花丹醌具有抑制炎癥、降低肝組織中膠原含量，減少肝纖維化相關(guān)因子表達等抗肝纖維化作用。本實驗結(jié)果表明，在白花丹醌中高劑量組作用24 h后，HSC-LX2細胞中α-SMA mRNA的水平明顯降低(P＜0.01);各藥物組HSC-LX2細胞中α-SMA蛋白表達面積縮小，顏色從棕黃色變?yōu)闇\黃色，與leptin對照組比較差異有顯著性，P＜0.01。這說明該藥可明顯抑制重組 leptin誘導(dǎo)HSC-LX2中α-SMA基因和蛋白的表達，提示白花丹醌抗肝纖維化的作用可能與其抑制HSC的活化及功能有關(guān):一方面，直接抑制HSC的增殖，降低其活力;另一方面，通過抑制HSC的功能，降低α-SMA的分泌量及表達水平，從而降低肝臟的纖維化程度及其誘導(dǎo)HSC增殖活化的能力。因此，根據(jù)以上結(jié)果和結(jié)合白花丹體內(nèi)抗肝纖維化作用的研究結(jié)果，說明白花丹醌抗肝纖維化作用機制之一是從mRNA水平和蛋白水平抑制α-SMA表達，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

［1］趙鐵建，方 卓.白花丹的藥學研究與臨床應(yīng)用概述［J］.中醫(yī)文獻雜志，2006，24(4):51-4.

［1］Zhao T J，F(xiàn)ang Z.The pharmaceutical research and clinical overview of plumbago.［J］.J Tradit Chin Med Lliter，2006，24(4):51-4.

［2］張吉仲，劉 圓，焦 濤.白花丹不同有機溶劑提取物和白花丹醌對移植性乳腺癌和S180肉瘤的作用［J］.中國藥理學通報，2008，24(8):1040-3.

［2］Zhang J Z，Liu Y，Jiao T.Antitumor activity of different organic solvents extracts and plumbagin from plumbago zeylanica L.on EMT-6 breast cancer and transplanting S180 in vivo［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1040-3.

［3］趙鐵建，鐘振國，方 卓，等.白花丹提取物抗小鼠肝纖維化作用的研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2005，25(4):50-2.

［3］Zhao T J，Zhong Z G，F(xiàn)ang Z，et al.Anti-hepatic fibrosis of extracts from plumbago in mice in vitro［J］.Guangxi J Tradit Chin Med，2005，25(4):50-2.

［4］Liu W，Saint D A.A new quantitative method of realtime RT-PCR based on simulation of polymerase chain reaction kinetic［J］.Anal Biochem，2002，302(1):52.

［5］孫嫵弋，魏 偉.肝星狀細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及可能的抗肝纖維化藥物作用新靶點［J］.中國藥理學通報，2006，22(12):1433-8.

［5］Sun W Y，Wei W.Signal transduction in hepatic stellate cells andpossible drug targets［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(12):1433-8.

［6］吳繁榮，陳飛虎，胡 偉，等.鬼針草總黃酮抗大鼠免疫性肝纖維化作用及部分機制探討［J］.中國藥理學通報，2008，24(6):753-6.

［6］Wu F R，Chen F H，Hu W，et al.Anti-fibrosis effect and mechanism of total flavones of Bidens bip innata L on immunological liverfibrosis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):753-6.

［7］張緒富，呂志平，劉曉燕.以肝星狀細胞為靶標的抗肝纖維化治療進展［J］.中國藥理學通報，2003，19(6):622-6.

［7］Zhang X F，Lü Z P，Liu X Y.The progression for the therapy ofliver fibrosis targeting to hepatic stellate cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(6):622-6.

［8］牛麗文，曹 琦，李 俊，等.JAK/STAT途徑調(diào)節(jié)瘦素誘導(dǎo)的肝星狀細胞Ⅰ型膠原基因的表達［J］.中國藥理學通報，2007，23(10):1280-5.

［8］Niu L W，Cao Q，Li J，et al.JAK/STAT pathway mediates leptininducedⅠcollagen mRNA expression in human hepatic stellate cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1280-5.

［9］Tanaka Y，Nouchi T，Yamane M，et al.Phenotypic modulation in lipocytes in experimental liver fibrosis［J］.J Pathol，1991，164(3):273-84.