白寶清, 趙麗嬌, 宋秀慶, 鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124)

DNA股間交聯(lián)是一種重要的DNA損傷形式，能夠影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等[1]。許多抗癌烷化劑能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞中DNA互補堿基對發(fā)生股間交聯(lián)，引起腫瘤細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抗癌的目的[2，3]。臨床上應(yīng)用的抗癌藥物氯乙基亞硝基脲(CENUs)是一種DNA交聯(lián)劑[4～7]，其抗癌機制與導(dǎo)致DNA形成股間交聯(lián)物密切相關(guān)。研究[8～11]表明CENUs首先分解產(chǎn)生氯乙基正離子，氯乙基正離子和一條DNA鏈上鳥嘌呤的O6-發(fā)生烷基化作用，生成O6-氯乙基鳥嘌呤，然后經(jīng)過分子內(nèi)重排再和另一條DNA鏈上胞嘧啶的N3-發(fā)生烷化，生成具有細(xì)胞毒性的DNA股間交聯(lián)產(chǎn)物1-[N-(2′-脫氧胞基)]-2-[N-(2′-脫氧鳥基)]乙烷(dG-dC)。與CENUs結(jié)構(gòu)類似的亞硝胺也能夠?qū)е翫NA交聯(lián)。Ishikawa等[12]合成了具有氯烷基側(cè)鏈的亞硝胺并檢測了其對鼠傷寒沙門氏菌TA1535和TA92的細(xì)胞毒性，表明氯烷基亞硝胺能夠像CENUs一樣導(dǎo)致DNA損傷，生成dG-dC交聯(lián)。本實驗室曾對亞硝胺的致癌作用機理進(jìn)行了研究[13～15]，結(jié)果表明亞硝胺側(cè)鏈的α-位和β-位代謝生成雙親電活性中心，能夠?qū)е耫G的O6-和dC的N3-之間發(fā)生橫向交聯(lián)，即形成dG-dC。由于dG-dC在DNA中的含量往往非常低[16]，因此建立高靈敏度的檢測方法對于評價DNA的損傷程度，闡明股間交聯(lián)與抗癌(或致癌)作用之間的關(guān)系具有重要意義。

Scheme 1

本文以2′-脫氧鳥苷(dG), 2′-脫氧胞苷(dC), 2-氟乙醇等為原料合成了dG-dC，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, IR和MS表征。并以dG-dC為標(biāo)準(zhǔn)品，用HPLC-MS對1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)導(dǎo)致DNA股間交聯(lián)的損傷產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

WRS-IA型數(shù)字熔點儀；BRUKER AC-P400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))； BRUKER VERTEX 70型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Thermo-Finnigan SURVEYOR型高效液相色譜和TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)； J-KEM 6位恒溫平行合成儀；Eppendorf 5355恒溫振蕩混勻器；Labconco真空冷凍離心濃縮儀；HERMLE公司Z-323K高速冷凍離心機。

硅膠200目～300目,其余所用試劑均為分析純。

1．2 合成

(1) dG的乙酰化保護(hù)

在圓底燒瓶中依次加入dG 650 mg(2.5 mmol),無水吡啶100 mL,醋酸酐2.4 mL(25 mmol), 4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 30 mg(0.25 mmol)和三乙胺3.8 mL(28 mmol)，放入攪拌子，于50 ℃反應(yīng)30 h。加冷水20 mL,減壓蒸去吡啶和水得棕黑色油狀液體;再加去離子水40 mL，濃縮，冷卻后析出黃色晶體;用40%甲醇重結(jié)晶得淺黃色晶體1(乙?；Ｗo(hù)的dG) 0.8 g，收率78%, m.p.126.5 ℃～128.5 ℃; UVλ: 263, 279 nm;1H NMRδ: 2.12(s, 3H, CH3), 2.13(s, 3H, CH3), 2.32(s, 3H, CH3), 2.49～3.04 (m, 2H, 3′-H), 4.36～4.76(m, 2H, 6′-H), 5.41～5.44(m, 1H, 5′-H), 6.19～6.23(m, 1H, 2′-H), 7.75(s, 1H, 9-H), 9.44(s, 1H, NH), 11.99(s, 1H, 4-NH); IRν: 3 121, 2 920, 1 788, 1 751, 1 715, 1 688, 1 598, 1 551, 1 462, 1 399, 1 223, 1 139, 1 056, 997, 874, 779, 643 cm-1; ESI-MSm/z: 394{[M+H]+}。

(2)O6-(2-氟乙基)-2′-脫氧鳥苷(2)的合成

在圓底燒瓶中加入1540 mg(1.3 mmol)的無水吡啶(100 mL)溶液,減壓蒸去吡啶(以除去1晶體中的水)得淡黃色固體。依次加入無水二氧環(huán)己烷6 mL,三苯基膦1.260 g(4.8 mmol),偶氮二甲酸二乙酯750μL(4.8 mmol)和2-氟乙醇312μL(5.1 mmol)，攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。加入5%NaHCO3溶液30 mL,攪拌15 min后用二氯甲烷(3×50 mL)萃取,合并萃取液，蒸除溶劑得黃色油狀液體。加甲醇10 mL溶解，加濃氨水60 mL，攪拌下于60 ℃反應(yīng)3 h。蒸去甲醇和NH4OH得黃色油狀液體。用20%甲醇溶解，冷卻后過濾,濾液濃縮得黃色油狀液體,經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1∶5～1∶15]純化得白色固體2 130 mg,產(chǎn)率30%, m.p.241.5 ℃～243.5 ℃; UVλ: 248, 282 nm;1H NMR(DMSO-d6)δ: 2.19～2.24(m, 2H, 3′-H), 3.49～3.59(m, 1H, 4′-H), 3.82(s, 1H, 4′-OH), 4.36～4.37(m, 1H, 5′-H), 4.60～4.70(m, 2H, 6′-H), 4.72～4.85(m, 2H, 10-H), 4.96～5.27(m, 2H, 11-H), 6.20～6.24(t,J=6.0 Hz, 1H, 2′-H), 6.46(s, 2H, NH2), 8.11(s, 1H, 9-H); IRν: 3 321, 2 920, 1 788, 1 751, 1 715, 1 687, 1 598, 1 551, 1 399, 1 379, 1 224, 1 101, 1 055, 1 016, 997, 939, 874, 779, 722, 662 cm-1; ESI-MSm/z: 314{[M+H]+}。

(3) dG-dC的合成

在離心管中依次加入2 5 mg(12.8μmol), dC 10 mg(44μmol),二甲基亞砜100μL，置旋渦混合器上振蕩使其充分溶解，移至恒溫振蕩混勻器上于55 ℃反應(yīng)20 d。移至圓底燒瓶中，加水10 mL，減壓蒸去溶劑得淡黃色油狀液體，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶8]純化得淡黃色固體。

淡黃色固體溶于甲醇后經(jīng)反相HPLC(表1)純化，低溫凍干得白色固體dG-dC 2.5 mg，產(chǎn)率30%, m.p.218.7 ℃～220.7 ℃; UVλ: 260, 272 nm;1H NMR(DMSO-d6)δ: 2.11～2.45(m, 2H, 3′-H), 3.51～3.58(m, 4H, 10，11-H), 3.75～3.81(m, 4H, OH), 4.05～4.07(m, 2H, 4′-H), 4.20～4.22(m, 4H, 6′-H), 4.33～4.35(m, 2H, 5′-H), 5.85～5.87(d,J=8.4 Hz, 1H, 5-H)，6.11～6.16(m, 2H, 2′-H), 7.33～7.35(d,J=8.0 Hz, 1H, -H), 7.80(s, 2H, NH2), 7.92(s, 1H, 9-H), 11.89(s, 1H, NH); IRν: 3 392, 3 242, 1 750, 1 696, 1 652, 1 539, 1 410, 1 243, 1 095, 1 066, 1 018, 954, 781, 761, 654, 594 cm-1; ESI-MSm/z: 521{[M+H]+}。

表 1 反相HPLC純化dG-dC的條件*Table 1 The reversed-phase HPLC conditions purifing dG-dC

*Agilent Zorbax SB C18柱(4.6×250 mm, 5μm)，柱溫25 ℃,檢測波長260 nm;用混合溶劑[A： 10 mmol·L-1NH4Ac水溶液(0.1%AcOH)， B： 乙腈]作梯度洗脫,流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量20μL

1.3 dG-dC在DNA股間交聯(lián)檢測中的應(yīng)用

(1) BCNU與小牛胸腺DNA的反應(yīng)

用10 mmol·L-1Tris-HCl, 50 mmol·L-1NaCl溶液, 50 mmol·L-1NaH2PO4溶液配制磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)。

在反應(yīng)瓶中依次加入小牛胸腺DNA 10 mg,磷酸鹽緩沖溶液10 mL,混勻后加熱至37 ℃,加入BCNU 2 mg和無水乙醇(20μL)溶液,置平行合成儀上于37 ℃避光反應(yīng)5 d(每隔12 h加入等量BCNU溶液)。取0.4 mL反應(yīng)溶液于1.5 mL離心管中,加入冷無水乙醇0.8 mL，混勻，靜置，得到絮狀沉淀;以15 000 rpm離心5 min棄去上清液得白色片狀沉淀;加入75%乙醇1 mL，振蕩漂洗，以15 000 rpm離心2 min，棄去上清液,沉淀于4 ℃揮發(fā)乙醇;10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.0) 0.4 mL溶解制得含BCNU與小牛胸腺DNA交聯(lián)產(chǎn)物(BCNU-DNA)的溶液。

(2) BCNU-DNA的酶解

在離心管中加入BCNU-DNA溶液 100μL,于98 ℃熱變性5 min,迅速放入冰浴中冷卻10 min(使DNA雙鏈變性為單鏈)。加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ) 5 μL(300 U)， S1核酸酶5μL(1000 U)， S1核酸酶緩沖液(10 mmol·L-1AcONa, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05 mmol·L-1ZnSO4, pH 4.6) 20μL，于37 ℃酸性酶解3 h。加入堿性磷酸酶(CIAP) 5μL(150 U)，蛇毒磷酸二酯酶10μL(1 U)， CIAP緩沖液(500 mmol·L-1Tris-HCl, 10 mmol·L-1MgCl2, pH 9.0) 50μL，于37 ℃堿性酶解3 h。以15 000 rpm離心30 min，上清液即BCNU-DNA酶解液。

(3) BCNU-DNA的HPLC-MS檢測

HPLC條件：Thermo ODS C18反相柱(2.1×150 mm, 5μm),柱溫25 ℃,檢測波長260 nm;用混合溶劑作梯度洗脫(表2),流速0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量5μL。MS條件：用正離子模式進(jìn)行檢測；ESI源設(shè)置為噴霧電壓4 kV，鞘氣壓力35 psi，輔氣壓力5 psi，毛細(xì)管溫度300 ℃，導(dǎo)管入口補償電壓141 V。采用一和二級全掃描(MS Full Scan)方式進(jìn)行檢測。

表 2 BCNU-DNA的HPLC-MS檢測中的梯度洗脫條件*Table 2 The gradient elution conditions in HPLC-MS detection of BCNU-DNA

*同表1

2 結(jié)果與討論

2.1 dG-dC的合成與純化

合成均在無水條件下進(jìn)行，所用試劑需無水或進(jìn)行無水處理。為了提高底物(dG)的轉(zhuǎn)化率,所用醋酸酐,4-二甲基氨基吡啶，三乙胺，三苯基膦，偶氮二甲酸二乙酯，2-氟乙醇，dC均過量。由于反應(yīng)時間比較長，反應(yīng)溫度不宜高于50 ℃；產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶時要除去不溶于水的雜質(zhì)，以40%甲醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。2在加氨水去保護(hù)時要在反應(yīng)裝置上接氣球，延緩加熱反應(yīng)時揮發(fā)的氨氣擴散到空氣中，以便盡可能的除去乙酰基。柱層析純化2時，淋洗液的極性逐漸增大，以便加快洗脫速度。合成dG-dC的反應(yīng)時間長達(dá)20 d，為了提高產(chǎn)率，反應(yīng)溫度不能大于55 ℃，否則會生成去一分子的葡萄糖的副產(chǎn)物，從而降低產(chǎn)率。用反相HPLC純化dG-dC時各組分的保留時間分別為：tdG-dC=15.09 min， tdC=3.58 min, t2=21.29 min， t副=12.18 min。

2.2 dG-dC的表征

1H NMR譜數(shù)據(jù)表明，1中4-NH位于11.98, 9-H于位于7.75， 氨基被乙酰基保護(hù)后，受電負(fù)性較大的氧原子影響，氨基上剩余H的化學(xué)位移向低場(9.444)。2 中9-H位于8.11, NH2位于6.46。dG-dC中9-H位于7.80, NH2位于7.915。

1在3 121 cm-1處的吸收峰為N-H基團(tuán)的特征峰，由于受羰基氧原子吸電子的誘導(dǎo)效應(yīng)的影響，N-H鍵的伸縮振動發(fā)生了紅移。在1 788 cm-1, 1 751 cm-1, 1 715 cm-1和1 688 cm-1有四個強的吸收峰, 表征四個羰基(C=O伸縮振動)；在1 688 cm-1～1 598 cm-1出現(xiàn)C=N的較強特征吸收峰。2在3 321 cm-1有強的O-H吸收峰，在1 687 cm-1～1 551 cm-1出現(xiàn)C=N 的較強特征吸收峰。dG-dC在3 392 cm-1和3 242 cm-1出現(xiàn)強吸收峰分別對應(yīng)O-H 和N-H 的伸縮振動，在1 696 cm-1～1 539 cm-1出現(xiàn)C=N 的較強特征吸收峰。

1,2和dG-dC的一級質(zhì)譜圖中均有準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,由于在離子化過程中很容易脫去葡萄糖中性碎片(m/z116)，因此各化合物的一級譜圖中均有m/z[M+H-116]+的碎片離子峰。dG-dC一級全掃描質(zhì)譜圖除了有m/z521[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰和m/z405[M+H-116]+的碎片離子峰外，還有脫去兩分子葡萄糖的碎片離子峰m/z289[M+H-2×116]+。

2.3 dG-dC用于BCNU-DNA酶解液的HPLC-MS定性分析

以dG-dC為標(biāo)準(zhǔn)品，對BCNU-DNA酶解液作HPLC-MS定性分析，均在11.94 min出峰，說明BCNU-DNA酶解液中可能含有dG-dC。但是由于BCNU-DNA酶解液中該峰的強度很小(相對強度僅為1.5%)，所以我們通過一級質(zhì)譜全掃描提取了m/z405和m/z289的離子流圖，同時在11.94 min處得到了明顯的譜峰(信噪比分別為433和1 621)，為了進(jìn)一步確認(rèn)BCNU-DNA酶解液中m/z289碎片離子的結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行了二級全掃描，得到了與標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣的碎片離子峰，包括m/z238,m/z196,m/z178和m/z152，其中m/z178為基峰。結(jié)果表明，BCNU和小牛胸腺DNA反應(yīng)導(dǎo)致鳥嘌呤和胞嘧啶之間形成乙撐方式共價連接的交聯(lián)物，這與前人[17]提出的有關(guān)BCNU導(dǎo)致DNA股間交聯(lián)的反應(yīng)機理相吻合。本研究為今后進(jìn)一步對DNA交聯(lián)進(jìn)行定量分析建立了可行的實驗方法。

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